白 勇, 孫安盛， 吳 芹

(1.貴州遵義醫(yī)學院藥理教研室，貴州 遵義 563003； 2.鄭州市衛(wèi)生學校藥理教研室，河南 鄭州 450005)

腫瘤目前已經超過心血管疾病成為致人死亡的第一殺手，在發(fā)達國家和我國的大中城市，腫瘤的發(fā)病率也在逐年提高[1]。預防和治療癌癥,仍是我們關注的課題。當前從傳統(tǒng)醫(yī)藥特別是中草藥中尋找多靶點、毒副作用小的抗腫瘤藥物已成為國內外醫(yī)藥學專家關注的焦點。

作為我國目前研究較多的中藥代表沙苑子總黃酮和百草酸，兩者的許多藥理作用都受到了關注。沙苑子為豆科植物扁莖黃芪AstraguluscomplanatusR.Br干燥成熟的種子。具有溫補肝腎、固精、縮尿、益肝明目的功能。藥理研究沙苑子總黃酮(flavonoids extracts fromAstragalicomplanatiSemen)具有改善血液流變學指標、降低血壓、調節(jié)血脂、抑制血小板聚集、保護肝臟、增強免疫功能、抗炎、鎮(zhèn)痛及調節(jié)中樞神經系統(tǒng)等作用[2]。百草酸主要成分為熊果酸 (ursolic acid)，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗?jié)儭⒔档脱?、抗氧化等功能[3]。目前對上述兩種藥物報道的沙苑子總黃酮和百草酸對體內外的抗腫瘤作用，并初探其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥品、細胞、試劑和儀器 沙苑子總黃酮由蘇州中藥所植化室提供；百草酸由上海師范大學楊慶堯教授提供，其中體內使用的熊果酸水平為87%，體外使用的熊果酸純度99.5%；環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司)，國藥準字H31021703，批號060107，200 mg/瓶；羥基喜樹堿(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)，國藥準字H23022626，批號050901A，2 mL 1支，2 mg/支。S180肉瘤細胞來自蘇州大學藥理學教研室。人結腸癌細胞株SW620購自中國科學院上海細胞生物研究所的細胞庫。MTT(南京興生生物)；RT 試劑(大連寶生物公司)；P53、Bcl-2、Bax及β-actin的引物由大連寶生物設計(表1)，上海皓嘉生物科技有限公司合成，由TaKaRa生物工程公司合成。二甲基亞砜(DMSO)(上海化學試劑廠)；生產RNA 逆轉錄儀(德國Eppendorf公司)；PCR熱循環(huán)儀(美國BIO-RAD公司)；電子天平(北京賽多利斯電子有限公司)；倒置顯微鏡(美國Napco公司)。

表1 各基因的引物序列

1.2 實驗動物、分組及藥物的配制 昆明種小鼠，體質量18～22 g，120只，清潔級，由蘇州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：XCYK(蘇)2002-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2002-0037。飼養(yǎng)環(huán)境的室溫控制在20～25 ℃，室內安靜，每日光照12 h，動物自由進食、飲水。隨機分為11組，每組小鼠10只，分別為：(1)模型組；(2)環(huán)磷酰胺25 mg/kg組；(3)羥基喜樹堿5 mg/kg組；(4)沙苑子總黃酮50 mg/kg組；(5)沙苑子總黃酮100 mg/kg組；(6)沙苑子總黃酮200 mg/kg組；(7)沙苑子總黃酮400 mg/kg；(8)百草酸50 mg/kg組；(9)百草酸100 mg/kg組；(10)百草酸200 mg/kg組；(11)百草酸400 mg/kg組[4-6]。由于沙苑子總黃酮易溶于水，百草酸不溶于水，兩種藥分別制成溶液和混懸液，環(huán)磷酰胺用生理鹽水溶解，灌胃給藥。MTT溶液：取適量MTT溶于PBS中，使其終質量濃度為5 mg/mL，過濾除菌，分裝，避光保存。

1.3 動物模型的制備、給藥及處理 抽取S180肉瘤小鼠腹腔的腹水，用生理鹽水以1∶4比例混勻，記數(shù)按(2～4)×106/只接種數(shù)接種在小鼠的右側腋窩皮下[7]。小鼠接種S180肉瘤腹水后的第2天，稱定質量，每日按0.2 mL/10 g體質量分別灌服給藥模型組灌服蒸餾水；環(huán)磷酰胺對照組每日按0.2 mL/10 g體質量分別灌服環(huán)磷酰胺；給藥組隔天稱定質量連續(xù)給藥10 d，羥基喜樹堿對照組每日按0.1 mL/10 g腹腔注射，隔天1次，第11天各組小鼠稱定質量后頸椎脫臼處死，剝取腫瘤、脾臟、胸腺并稱定質量[8]。

相關的計算公式：體內抑瘤率[9](inhibitive rate of tumorinvivo)=(1-給藥組瘤定質量/模型組瘤定質量)×100%；胸腺指數(shù)及脾指數(shù)計算公式[10]：胸腺指數(shù)(Thymus index, TI)=胸腺質量(mg)/體質量(g)；脾指數(shù)(Spleen index,SI)=脾質量(mg)/體質量(g)。

1.4 腫瘤細胞的培養(yǎng)、接種、給藥及抑制率檢測 SW620細胞5×105個/mL懸液，置于L-15培養(yǎng)液，培養(yǎng)液含10% FBS，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng), 隔日換液，3～4 d傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。取對數(shù)生長期腫瘤細胞5×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。24 h后加入不同質量濃度熊果酸(10、20、30、40、50 μmol/L)[11-12]， 對照組加0.6%DMSO，每組均設6個復孔，取其均值計算增殖抑制率, 并求其IC50，離心后吸凈上清，每孔加入100 μL DMSO，輕微震蕩10 min，待結晶充分溶解，于酶標儀(波長490 nm)檢測吸光度A值。分別檢測 12、24、36、48、72 h的A值，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線。

腫瘤細胞生長抑制率=[(A對照組-A實驗組)/A對照組] × 100%

1.5 相關基因的mRNA表達測定 取對數(shù)生長期SW620細胞，分為DMSO對照組，熊果酸40 μmol/L組(分別處理3、6、12、24、48 h)。按Trizol試劑盒說明提取細胞總mRNA，收集細胞加入1 mL Trizol液，勻漿，室溫靜置10～15 min，使細胞完全破壁。取勻漿轉入Eppendorf管中，加入三氯甲烷0.2 mL，劇烈震蕩15 s，室溫靜置 2～3 min，4 ℃離心12 000 r/min×15 min，轉移上層無色水相至另一Eppendorf管中。加入 0.5 ml 異丙醇，混勻，室溫靜置10 min; 4 ℃離心12 000 r/min×10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀一次，4 ℃離心7 500 r/min×5 min，室溫干燥沉淀5 min，取適量DEPC水溶解沉淀，并在室溫靜置10 min，使沉淀完全溶解，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。測定制備mRNA樣本的OD260/280的比值及進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測mRNA的純度和完整性，并根據其來定量。逆轉錄合成cDNA(逆轉錄反應體系: 5×primescriptTMBuffer(for Real Time) 2.0 μL；primescriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μL；Oligo(dT)premier(50 μM) 0.5 μL；Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL；Total RNA 1.0 μL；Rnase Free dH2O 5.5 μL；Total 10.0 μL)，加以上試劑的操作均在冰盒上進行，然后在儀器中逆轉錄(兩步法：時間分別為15 min 30 s)逆轉錄反應產物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結果

2.1 沙苑子總黃酮和百草酸對體內腫瘤的影響 分組時及術前各組小鼠的體質量無差異，各組均長出腫瘤，說明造模成功，環(huán)磷酰胺組在造模后7 d和10 d各死亡1只，環(huán)磷酰胺組對胸腺有明顯的促進作用(P<0.05)，羥基喜樹堿組對脾臟有明顯的促進作用(P<0.05)，均無明顯抑制作用通過與模型組和陽性組比較可以得出，沙苑子總黃酮和百草酸對S180肉瘤小鼠均有抑制作用，百草酸的抑制作用更加明顯(P<0.05)。上述兩藥對胸腺和脾臟均無明顯抑制作用(P>0.05)(表2)。

表2 沙苑子總黃酮和百草酸對小鼠S180腫瘤的作用

2.2 沙苑子總黃酮和熊果酸對體外腫瘤細胞的影響 倒置下觀察, 正常對照組細胞呈梭形，生長良好，且融合形成集落(圖1-a)。熊果酸作用24 h后，細胞死亡增多(圖1-b)。加入熊果酸30～50 μmol/L對SW620細胞增殖產生明顯的抑制作用，且呈時間、質量濃度依賴性，熊果酸10，20 μmol/L未見沒有明顯影響(表3)。IC50計算軟件(1.00版本)統(tǒng)計結果顯示，熊果酸作用24、48、72 h的IC50分別為43.58、31.57、27.86 μmol/L。

圖1 SW620細胞(24 h×400)

表3 熊果酸對人結腸癌SW620細胞增殖的抑制作用

2.3 總mRNA提取結果分析 提取的熊果酸(40 μmol/L)作用的SW620的mRNA，先用25 μL DEPC水溶解后，取 2 μL 加水稀釋后用紫外分光光度計測定各樣本總RNA在波長260與280 nm處的OD值，OD260/280比值在1.8以上，表明抽提的RNA純度較高，無DNA污染(表4)。取 3 μL 加適量的溴芬蘭在含EB的1%瓊脂糖凝膠上點樣，110 V電壓下電泳15 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果?？梢娒髁燎逦?8 S 和18 S兩條RNA帶，說明提取的mRNA完整(圖2)。

表4 提取SW620細胞mRNA的質量和可信度

圖2 提取的總mRNA在1%瓊脂糖凝膠上的條帶

沙苑子總黃酮對人結腸癌SW620細胞無明顯抑制作用(P>0.05)，而熊果酸卻能明顯的抑制該腫瘤細胞(P<0.05)；熊果酸顯著上調促凋亡基因P53和Bax的表達(P<0.05)，下調抑凋亡基因Bcl-2的表達(P<0.05)(圖3)。

注：與對照組比較

3 討論

有研究證實沙苑子總黃酮和百草酸有抗腫瘤的作用[13-14]，通過對相關報道的深入研究，為開發(fā)利用傳統(tǒng)中藥奠定基礎。本研究采用通過體內體外篩選上述兩藥對腫瘤的作用，體內通過S180肉瘤模型證實了沙苑子總黃酮具有一定的抗腫瘤作用(僅200 mg/kg，抑制率23.52%<30%；400 mg/kg，抑制率41.67%>30%)，而百草酸具有較強的抗腫瘤作用(50 mg/kg，抑制率37.34%>30%；100 mg/kg，抑制率42.32%>30%)，體外抗腫瘤模型從兩藥對人結腸癌細胞的作用證實了熊果酸抗腫瘤作用明顯(40～50 μmol /L，>24 h)，其機制至少與上調凋亡基因P53和Bax、下調Bcl-2等抑凋亡基因的mRNA表達有關。沙苑子總黃酮無體外的抗腫瘤作用。分析沙苑子總黃酮在體內有一定抗腫瘤作用，在體外抗腫瘤作用不明顯，其原因可能與沙苑子總黃酮本身的性質有關，該藥是含有多種成分的中成藥，對具體的相關成分的作用和含量研究不明確，它所表現(xiàn)的作用其實是多種成分共同作用的結果，這些成分在腫瘤相關因素中有抑制腫瘤和誘發(fā)腫瘤的兩方面，該批次的沙苑子總黃酮有一定的體內作用但是不明顯，說明抑制腫瘤和誘發(fā)腫瘤的綜合作用基本達到平衡。由此，本課題組考慮在以后的研究中通過改進藥物制備技術和方法，保留更多的抗腫瘤成分，去掉一些誘發(fā)腫瘤發(fā)生的成分，當然這中間還有很多工作去做，比如，查閱或研究沙苑子總黃酮相關成分的含量和藥理作用，為最終藥物相關成分的取舍奠定基礎，從而得到理想的抗腫瘤中成藥。

百草酸中含有最多的成分是熊果酸，人們通過對熊果酸單體的研究證實了它在體內外的都有明顯的抗腫瘤作用，這樣就很容易理解為何百草酸在體內外都有明顯的抗腫瘤作用了。

通過對上述兩種中成藥體內外抗腫瘤作用的研究，發(fā)現(xiàn)要特別注意中成藥中主要成分的藥理作用，要想得到穩(wěn)定而有效的中成藥，必須要非常注意藥物的制備技術、方法與各種相關成分的作用所達到效果的關系。只有有目的的取舍，才能夠朝著目標邁進。

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