劉 玠 曲海影 張 迪

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心，黑龍江哈爾濱 150001

抗宮炎凝膠劑由廣東紫珠、益母草、烏藥三味中藥組成[1]，是在抗宮炎片的基礎(chǔ)上研制的現(xiàn)代中成藥[2]，抗宮炎片現(xiàn)收錄于《中國藥典》2010 年版一部[3]，用于慢性宮頸炎引起的濕熱下注、赤白帶下、宮頸糜爛、出血癥等[4]。 慢性宮頸炎是女性生殖系統(tǒng)最為常見的炎癥性疾病，多由急性宮頸炎治療不徹底轉(zhuǎn)化而來[5]，該病在已婚或有性生活的婦女中發(fā)病率高達(dá)50%以上，且是宮頸癌發(fā)病的高危因素之一[6]，其治療方法有物理療法、手術(shù)療法和藥物療法[7]，其中藥物療法因?qū)俜莿?chuàng)傷性治療，操作簡單，對患者要求低而應(yīng)用廣泛[8]。在藥物治療中，與抗宮炎片相比，抗宮炎凝膠劑直接作用于病灶[9]，不需要通過肝臟首過作用和胃腸道生理關(guān)卡效應(yīng)[10]，因而不會降低其病灶部位的有效濃度，也不會延長其起效時(shí)間及降低藥物的療效[11]。 而且抗宮炎凝膠劑與陰道黏膜具有良好的偶合和水合作用，可較長時(shí)間與病灶部位黏附緊密，能充盈整個(gè)陰道[12]，有較好的生物相容性，有利于藥物的釋放，能更好地發(fā)揮療效[13-14]，在中藥新藥研制中，幾乎所有的新藥都必須提供定性鑒別的分析。薄層色譜技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)在中藥成藥的定性鑒別中均是最常用的方法，均具有良好的專屬性、可比性及較高的靈敏度，依據(jù)高效液相色譜中色譜峰的位置以及薄層色譜板上斑點(diǎn)的有無、顏色、位置來判定中成藥所含原料藥物的真?zhèn)?，同時(shí)其斑點(diǎn)的大小、顏色的深淺亦可在一定程度上直接反映出所用原料藥材的優(yōu)劣。采用高效液相色譜分析技術(shù)和薄層色譜分析與其他色譜分析相比，二者顯著不同的是得到的圖譜是直觀性很強(qiáng)的圖像。為此，本研究決定改變原制劑的給藥途徑，將抗宮炎片改為抗宮炎凝膠劑，從新藥研究角度出發(fā)，參照《中國藥典》2010 年版一部抗宮炎片下的規(guī)定，采用高效液相色譜法（HPLC）和薄層色譜法（TLC）對抗宮炎凝膠劑處方中主要藥味進(jìn)行定性鑒別，旨在為制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，為慢性宮頸炎及宮頸糜爛的臨床治療提供更多的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters 1525-2489）；METTLER AE 200 電子天平（梅特勒托利多儀器公司）；AB204-N 電子分析天平（梅特勒托利多儀器公司）；指針式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KQ-500DB 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸水蘇堿對照品（批號：110712-201111，中國藥品生物制品檢定所）；烏藥醚內(nèi)酯對照品（批號：111568-200603，中國藥品生物制品檢定所）；金石蠶苷對照品（批號：111812-201001，中國藥品生物制品檢定所）；烏藥對照藥材（批號：121096-201004，中國藥品生物制品檢驗(yàn)所）；抗宮炎凝膠劑（自制，批號：20110901、20110902、20110903）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 益母草TLC 鑒別

取抗宮炎凝膠劑1 支（5.00 g），加入甲醇溶液50 mL使藥物溶解，將溶解的藥物溶液超聲處理30 min，將超聲處理后的溶液全部濾過，濾液蒸干，所得的殘?jiān)尤胍掖既芤? mL 使其溶解，即可以得到抗宮炎凝膠劑供試品溶液。 另取適量的鹽酸水蘇堿對照品，加適量乙醇溶液制成1 mL 含2 mg 的溶液，即可作為益母草對照品溶液。 按照上述的處方比例，使用相同的方法制成益母草陰性對照品溶液，照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取抗宮炎凝膠劑供試品溶液和益母草陰性對照品溶液各2 μL 以及益母草對照品溶液4 μL，后分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸（10∶6∶1）為本品所用的展開劑，將薄層色譜板放入展開缸內(nèi)完全展開后取出，晾干，先噴以10%硫酸乙醇溶液，再噴以新配制的稀碘化鉍鉀試液-碘化鉀碘試液（1∶1）混合液，后冷風(fēng)吹干，結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 益母草薄層色譜法

2.1.2 烏藥TLC 鑒別

取抗宮炎凝膠劑1 支（5.00 g），加入甲醇溶液25 mL使藥物溶解，所得的甲醇溶液水浴加熱回流30 min后將溶液濾過，濾液蒸干，將得到的藥物殘?jiān)诱麴s水20 mL，所得藥物溶液加熱使溶解，用三氯甲烷溶液連續(xù)振搖提取2 次，每次均用20 mL 的三氯甲烷溶液，合并三氯甲烷提取液，將提取液蒸干，所得殘?jiān)右宜嵋阴? mL 使其溶解，即可得到抗宮炎凝膠劑供試品溶液。另精密量取烏藥對照藥材2 g，加入蒸餾水50 mL，煎煮30 min，所得的全部溶液濾過，濾液離心，取得到的上清液濃縮至20 mL，用三氯甲烷溶液振搖提取2 次，每次均用20 mL 的三氯甲烷溶液，合并三氯甲烷提取液，將提取液蒸干，所得的殘?jiān)右宜嵋阴? mL 使溶解，制成烏藥對照藥材溶液。另精密量取烏藥醚內(nèi)酯對照品，加乙酸乙酯溶液適量制成每1 毫升含2 mg 的溶液，作為烏藥對照品溶液，按照原處方比例，同法制成烏藥陰性對照品溶液。 照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，分別吸取抗宮炎凝膠劑供試品溶液16 μL、烏藥對照藥材溶液4 μL、烏藥對照品溶液1 μL，以及烏藥陰性對照品溶液1 μL 后分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（15∶1）為展開劑，將薄層色譜板放入展開缸內(nèi)完全展開后取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸試液，用冷風(fēng)吹干。 日光檢視，在供試品色譜中，分別在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，見圖2。

2.2 HPLC 定性鑒別

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-0.5%磷酸（18∶82）；檢測波長：332 nm；流速：1.0 mL/min；理論板數(shù)按金石蠶苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

圖2 烏藥薄層色譜法

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品制備方法的考察 ①超聲：稱取抗宮炎凝膠劑供試品5.00 g，將藥物置于圓底燒瓶中，精密吸取50%甲醇溶液50 mL，將溶液超聲處理60 min后所得溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用適量50%甲醇溶液洗滌錐形瓶，洗液并入容量瓶，用50%甲醇溶液定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為抗宮炎凝膠劑的供試品溶液。②水浴回流：稱取抗宮炎凝膠劑供試品5.00 g， 置圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL 后，精密稱定溶液重量，水浴加熱回流1 h 后，所得溶液放冷，再精密稱定溶液重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失溶液的重量，搖勻，溶液過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）將其濾過，即可以得到抗宮炎凝膠劑供試品溶液。 ③測定法：分別精密吸取金石蠶苷對照品溶液10 μL 與上述兩種抗宮炎凝膠劑供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定、記錄色譜圖。結(jié)果顯示，加熱回流提取的效果明顯優(yōu)于超聲提取，故本實(shí)驗(yàn)選用加熱回流提取方法。見表1。

表1 供試品制備提取時(shí)間及方法篩選

2.2.2.2 提取時(shí)間的選擇 取抗宮炎凝膠劑5.00 g 3 份，精密稱定藥物的重量，3 份藥物分別置圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL， 精密稱定溶液重量，將3 份藥物溶液分別用水浴加熱回流提取0.5、1、1.5 h后放冷，再精密稱定溶液重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為抗宮炎凝膠劑供試品溶液。并按擬定的色譜條件測定。通過比較超聲與加熱回流提取方法與選擇提取時(shí)間的試驗(yàn)，優(yōu)化了供試品制備的條件，確定了樣品處理方法：精密稱取供試品5.00 g，將藥物置于圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定溶液重量，用水浴加熱回流1 h 后放冷，再稱定溶液重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。 見表1。

2.2.2.3 溶液的制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取適量的金石蠶苷對照品，加入50%色譜甲醇溶液制成每1 毫升含金石蠶苷約0.156 mg 的對照品溶液。 ②供試品溶液的制備：取抗宮炎凝膠劑樣品5.00 g，精密稱定其重量，將藥物置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定溶液重量，水浴加熱回流1 h，放冷，再稱定溶液重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液10 μL 與供試品溶液5 μL 注入液相色譜儀，測定和記錄色譜圖，結(jié)果廣東紫珠在供試品色譜中呈現(xiàn)出與對照品色譜中保留時(shí)間相同的金石蠶苷色譜峰（t = 5.51 min），見圖3、4。

圖3 金石蠶苷對照品高效液相色譜圖

圖4 抗宮炎凝膠劑供試品高效液相色譜圖

3 討論

3.1 薄層色譜定性鑒別研究

本實(shí)驗(yàn)探討了抗宮炎凝膠劑成品中主要成分烏藥、益母草的薄層色譜定性鑒別研究，結(jié)果表明，薄層色譜中具有益母草和烏藥的顯著鑒別特征，各檢出成分不受處方中其他藥的干擾，方法穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰，可作為抗宮炎凝膠劑的有效定性鑒別方法。

3.2 高效液相定性鑒別研究

3.2.1 供試品制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)探討了超聲提取法和加熱回流提取法兩種方法，根據(jù)結(jié)果顯示加熱回流提取的效果明顯優(yōu)于超聲提取，故本實(shí)驗(yàn)選用加熱回流提取方法。

3.2.2 提取時(shí)間的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了加熱回流提取0.5、1、1.5 h，結(jié)果表明提取時(shí)間為1 h 時(shí)，樣品的含量最高，故本實(shí)驗(yàn)采取回流1 h 的提取時(shí)間，最終確定樣品的最佳提取工藝為加熱回流1 h。

3.3 研究意義

抗宮炎凝膠劑作為治療慢性宮頸炎外用藥新劑型[15]，是近幾年局部用藥的研究熱點(diǎn)[16]，應(yīng)用于陰道給藥的凝膠主要為水溶性凝膠[17-18]，具有與吸附處的黏膜緊密結(jié)合，具有制備工藝簡單、形狀美觀、易于涂布使用、易清洗、不污染衣物、穩(wěn)定性較好等特點(diǎn)[19-20]，因患者使用無異物感，順應(yīng)性強(qiáng)，能充盈整個(gè)陰道[21]，是陰道給藥治療宮頸疾病的一種理想劑型。所以抗宮炎凝膠劑臨床療效好，尤其與物理治療、手術(shù)治療相結(jié)合使用時(shí)，對慢性宮頸炎的治愈率更高，本研究為治療婦科疾病臨床用藥的劑型發(fā)展開辟了新道路。

綜上所述，本研究對抗宮炎凝膠劑成品中的主要成分廣東紫珠進(jìn)行的高效液相定性鑒別研究，結(jié)果表明，廣東紫珠在供試品色譜中呈現(xiàn)出與對照品色譜中保留時(shí)間相同的色譜峰，所以本方法可作為抗宮炎凝膠劑的有效鑒別方法。

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