韋竑宇 梁 立

中日友好醫(yī)院脊柱外科，北京 100029

他莫昔芬作為乳腺癌患者內(nèi)分泌治療藥物在臨床已被廣泛應(yīng)用。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬在缺血缺氧性腦損傷、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）、腦出血等疾病中可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]。但他莫昔芬在SCI 中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制仍是未解之謎。

本研究旨在通過(guò)檢測(cè)核因子kappa B p65 （NFκB p65）及磷酸化核因子κB 抑制因子α（pI-κB α）表達(dá)，觀察他莫昔芬對(duì)核因子-kappa B 抑制蛋白激酶復(fù)合體/核因子kappa B（IKK/NF-κB）通路的調(diào)控；通過(guò)檢測(cè)活性半胱天冬酶-3（caspase-3）活化水平，觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響； 通過(guò)檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，觀察其對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，從而探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠51 只（由中日友好醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），鼠齡10～12 周，體重200～220 g，隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組（n=17，僅行椎板切除術(shù)）； 對(duì)照組 （n=17，SCI+硬膜下注射二甲基亞砜）；他莫昔芬組（n=17，SCI+硬膜下注射他莫昔芬）。

1.2 模型制備及給藥

3 組大鼠麻醉后，假手術(shù)組僅行T11～T13段椎板切除。其余兩組以T12棘突為中心，咬除椎板，暴露脊髓，用質(zhì)量為20 g 的不銹鋼棒從12.5 mm 高處垂直落下（打擊量25 g·cm），誘發(fā)脊髓損傷。

SCI 后30 min，對(duì)照組硬膜下注射2%二甲基亞砜5 mL/kg； 他莫昔芬組損傷部位硬膜下注射他莫昔芬5 mg/kg（溶于2%二甲基亞砜1 mg/mL）。

術(shù)后24 h，3 組大鼠以10%水合氯醛（600 mg/kg）麻醉后， 以含有1 U/mL 肝素的生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗，截取10 mm 損傷節(jié)段脊髓，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫印跡法檢測(cè)NF-κB p65、pI-κB α 和活性caspase-3

蛋白提取按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（普利萊基因有限公司， 北京），BCA 法蛋白定量檢測(cè)濃度（普利萊基因有限公司，北京），計(jì)算蛋白電泳加樣量。根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉、4℃一抗過(guò)夜， 一抗分別為小鼠抗大鼠NF-κB p65 單克隆抗體（1∶1000，Santa Cruz 公司，美國(guó)）、兔抗大鼠pIκB α 單克隆抗體（1∶500，Cell Signalling 公司，美國(guó)）、兔抗大鼠活性caspase-3 單克隆抗體 （1∶1000，Cell Signalling 公司，美國(guó)）；洗膜，將標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔或羊抗小鼠二抗分別加入二抗稀釋液中（1∶2000，Jackson West Grove 公司，美國(guó)），37℃孵育1 h，漂洗二抗，ECL 法發(fā)光（ECL 試劑盒：普利萊基因有限公司，北京）。 X 線曝光10 s～1 min。 掃描膠片，運(yùn)用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國(guó)） 進(jìn)行灰度值分析， 以其光密度（Optical density，OD）表示。

1.4 比色法檢測(cè)MPO 活性

脊髓組織中MPO 活性檢測(cè)按照MPO 活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在460 nm 處，1 cm 光徑，測(cè)各組OD 值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的計(jì)算公式，推算MPO 活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析（SPSS 公司，美國(guó)），計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析和Bonferrni 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65 的表達(dá)

免疫印跡法檢測(cè)各組脊髓組織NF-κB p65 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，對(duì)照組術(shù)后24 h NF-κB p65 的表達(dá)水平較高，他莫昔芬組NF-κB p65表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P ＜0.05）。 見(jiàn)圖1、表1。

圖1 核因子kappa B p65 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

2.2 pI-κB α 的表達(dá)

采用免疫印跡檢測(cè)各組脊髓組織中pI-κB α 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，對(duì)照組pI-κB α顯著升高， 而他莫昔芬明顯抑制了pI-κB α 的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。 見(jiàn)圖2、表1。

圖2 磷酸化核因子κB 抑制因子α 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

2.3 活性caspase-3 的表達(dá)

本研究選擇活性caspase-3 作為細(xì)胞凋亡相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：脊髓損傷24 h 后，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組活性caspase-3 表達(dá)水平明顯升高，他莫昔芬顯著降低了活性caspase-3 的表達(dá)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)圖3、表1。

圖3 活性半胱天冬酶-3 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表1 Western blot 結(jié)果定量分析（）

表1 Western blot 結(jié)果定量分析（）

注： 與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05； 與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；NF-κB p65：核因子kappa B p65；pI-κB α：磷酸化核因子κB 抑制因子α；caspase-3：活性半胱天冬酶-3

組別 只數(shù) NF-κB p65 pI-κB α caspase-3假手術(shù)組對(duì)照組他莫昔芬組17 17 17 0.31±0.03 3.17±0.12#1.55±0.07#*0.12±0.01 0.98±0.05#0.53±0.03#*0.08±0.01 1.03±0.05#0.36±0.02#*

2.4 MPO 活性

通過(guò)檢測(cè)脊髓組織中MPO 活性反映炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，結(jié)果顯示：假手術(shù)組中，MPO 活性極低，另外兩組則明顯升高， 其中對(duì)照組升高更為顯著 （P ＜0.05）。 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠術(shù)后24 h 脊髓組織中髓過(guò)氧化物酶活性（U/mg，）

表2 各組大鼠術(shù)后24 h 脊髓組織中髓過(guò)氧化物酶活性（U/mg，）

注：與假手術(shù)組比較，#P ＜0.05；與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；MPO：髓過(guò)氧化物酶

組別 只數(shù) MPO假手術(shù)組對(duì)照組他莫昔芬組17 17 17 0.06±0.01 0.64±0.03#0.35±0.02#*

3 討論

多個(gè)研究表明他莫昔芬可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，據(jù)報(bào)道， 他莫昔芬能夠減輕腦出血部位周?chē)?xì)胞水腫，減輕SCI 后組織水腫， 促進(jìn)癱瘓肢體的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[4-6]；在缺血缺氧過(guò)程中參與氧自由基的清除，從而大大減少過(guò)氧硝酸鹽的生成[7-8]；同時(shí)可減弱小膠質(zhì)細(xì)胞及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，發(fā)揮抗放射性腦損傷作用[9]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制炎性反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡可有效緩解脊髓損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[10-12]。本研究旨在觀察他莫昔芬對(duì)SCI 過(guò)程中炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

眾所周知， 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 家族是調(diào)控人體炎性反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，有多條路徑可激活NF-κB，I-κB激酶復(fù)合體磷酸化I-κB（I-κB α、I-κB β、I-κB ε）介導(dǎo)的經(jīng)典路徑在固有免疫的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道， 對(duì)IKK/NF-κB 通路的成功干預(yù)可有效緩解SCI的病理過(guò)程[13]。NF-κB 并非是一種單一蛋白，而是NFκB/Rel 家族成員構(gòu)成各種二聚體的總稱(chēng)。已知有5 種哺乳類(lèi)Rel 蛋白：NF-κB1 （p50 及其前體p105）、NFκB2（p52 及其前體p100）、c-Rel、RelA（p65）和RelB。 由p65：p50 構(gòu)成的異二聚體是絕大多數(shù)細(xì)胞最為常見(jiàn)的NF-κB 形式，而且，僅RelA（p65）和c-Rel 具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種藥物通過(guò)影響NF-κB通路及其基因產(chǎn)物在體外發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14-17]。 本研究選取p65 和pI-κB α 作為代表IKK/NF-κB 通路活化程度的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，他莫昔芬成功抑制了IKK/NF-κB 通路的傳導(dǎo)， 在兩組SCI 大鼠中檢測(cè)到pI-κB α 表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，而他莫昔芬的應(yīng)用降低了pI-κB α 的表達(dá)水平，同時(shí)使p65表達(dá)水平顯著降低。

SCI 發(fā)生后炎性反應(yīng)緊隨其來(lái)，炎癥細(xì)胞開(kāi)始釋放大量的促炎遞質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì)，如活性氧自由基ROS 和活性氮自由基RNS，加重脂質(zhì)過(guò)氧化，損害神經(jīng)元，從而加重神經(jīng)功能障礙[18]。 在所有炎癥細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞是最快到達(dá)損傷部位的。 MPO 是主要存在中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種酶，可催化過(guò)氧化氫和氯陰離子反應(yīng)生成次氯酸和氯胺類(lèi)，其活性的高低反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度、數(shù)量及活性，從而反映出炎癥的嚴(yán)重程度， 為判定脊髓損傷程度提供依據(jù)[19]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在SCI 組MPO 表達(dá)顯著升高，而應(yīng)用他莫昔芬可大大降低損傷脊髓組織內(nèi)MPO 的表達(dá)水平，下調(diào)了炎性反應(yīng)的程度。

SCI 中的另一關(guān)鍵病理過(guò)程是凋亡，Crowe 等[20]研究表明，在大鼠SCI 模型脊髓白質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。凋亡所致的軸突變性及白質(zhì)纖維脫髓鞘可最終引發(fā)神經(jīng)元功能損傷[21-23]。 細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)最重要的因子為caspase-3 蛋白酶[24]，它的激活是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，被稱(chēng)為“分子開(kāi)關(guān)”[25]。因此，caspase-3 的活性可反映損傷部位細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度。本研究發(fā)現(xiàn)，損傷24 h 后，對(duì)照組的活性caspase-3 表達(dá)明顯升高， 損傷部位注射他莫昔芬可顯著降低caspase-3活性，表明他莫昔芬在脊髓損傷中具有抗凋亡特性。

綜上所述，本研究提示他莫昔芬成功降低NF-κB p65 和pI-κB α 的表達(dá)，從而抑制IKK/NF-κB 通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。 通過(guò)檢測(cè)組織中MPO 活性證實(shí)了他莫昔芬可減少脊髓損傷部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)， 此外，他莫昔芬可降低caspase-3 活性發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

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