劉 毅 李志樑 江騰春 傅 強(qiáng)

1.廣州市從化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科，廣東廣州 510900；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510280

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由多種致病因素作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退和胰島素抵抗等引起的一種代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖和糖尿?yàn)橹饕卣?，典型DM 患者可出現(xiàn)多飲、多尿以及消瘦等癥狀。 DM 的慢性并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，更是導(dǎo)致其傷殘、死亡的主要原因。已有相關(guān)研究報道DM 并發(fā)癥的病理生理學(xué)改變主要是源自微血管病變和大血管病變，并且血管內(nèi)皮損傷是DM 血管病變的始動環(huán)節(jié)和病理生理基礎(chǔ)[1]。 黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中藥黃芪中的主要活性成分，既往體外實(shí)驗(yàn)[2-3]揭示其具有促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖以及改善內(nèi)皮功能等作用，從而可能有效干預(yù)DM 血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病過程。本研究是通過短期內(nèi)給予2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者足療程APS 治療， 從而探討APS 對T2DM 患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞 （circulating endothelial progenitor cells，cEPCs）數(shù)量及功能的影響。 旨在為APS 在DM慢性并發(fā)癥的臨床治療中提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象的選擇及排除標(biāo)準(zhǔn) 選擇2013 年10月～2014 年5 月間在廣州市從化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科住院治療且確診為T2DM 的患者69 例，分為APS 治療組（36 例）和常規(guī)治療組（33 例）。 T2DM 診斷參照1999年WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：高血壓、糖尿病等慢性疾病控制不佳；合并糖尿病并發(fā)癥；合并結(jié)締組織疾病、心血管系統(tǒng)疾病等影響EPCs 的因素；既往有他汀類藥物降脂治療史；炎癥、近期外傷、手術(shù)史；對黃芪多糖皮試陽性。 本實(shí)驗(yàn)均征得患者本人書面同意。 所有研究過程均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.1.2 藥物干預(yù) APS 治療組在普通西藥降糖治療的基礎(chǔ)上，每日通過靜脈滴注途徑加用注射用APS（商品名：伯恩，國藥準(zhǔn)字220040086，天津賽諾制藥有限公司）250 mg，療程為2 周；常規(guī)治療組僅給予常規(guī)西藥降糖治療。 為防止受試患者因既往使用APS 對研究結(jié)果產(chǎn)生影響，需確保所有入選受試者在參與研究前1 個月內(nèi)均無使用APS 治療。

1.2 材料與試劑

本研究全部實(shí)驗(yàn)依托于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心血管實(shí)驗(yàn)室完成。 實(shí)驗(yàn)所需材料及試劑包括：人纖維連接蛋白（human fibronectin protein，HFN），購自美國BD 公司；Transwell 小室， 購自美國康寧公司；Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍祝―il-AcLDL），購自美國Invitrogen 公司；胎牛血清，購自美國Gibco 公司；EGM-2MV 培養(yǎng)基，購自瑞士LONZA 公司；二苯基四氮唑溴鹽 （MTT） 以及FITC 標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ （FITCUEA-Ⅰ），均購自美國SIGMA 公司；單個核細(xì)胞分離液，購自天津?yàn)笊镏破饭?；Hanks 平衡鹽溶液，購自北京索萊寶科技公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素，均購自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 方法

1.3.1 EPCs 的分離與培養(yǎng) 對入選參與研究的病例均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周血10 mL，肝素抗凝后加入Hanks 平衡鹽溶液1∶1 混勻，沿試管壁緩慢加入20 mL 單個核細(xì)胞分離液，使用水平離心機(jī)（德國Eppendorf 公司） 以2000 r/min 離心20 min 后獲取所需要的單個核細(xì)胞并使用PBS 洗滌2 次， 經(jīng)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后， 將單個核細(xì)胞接種于包被有HFN 的培養(yǎng)板上，加入EGM-2MV 培養(yǎng)基（含20%胎牛血清以及青霉素、鏈霉素各100 U/mL）培養(yǎng)EPCs。

1.3.2 EPCs 的鑒定 換液培養(yǎng)至第7 天，使用PBS 洗掉非貼壁細(xì)胞后，將細(xì)胞爬片與Dil-AcLDL（24 μg/mL）于37℃條件下孵育1 h， 用倒置熒光顯微鏡 （日本Olympus 公司）觀察EPCs 對Dil-AcLDL 的攝取。確定染色效果后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，固定后用PBS 浸洗，加入FITC-UEA-Ⅰ（10 μg/mL）繼續(xù)于37℃條件下孵育1 h。 通過共聚焦顯微鏡（LSCM，德國Zeiss 公司）鑒定Dil-AcLDL 和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細(xì)胞即為正在分化的EPCs。 采用倒置熒光顯微鏡對隨機(jī)選擇的5 個視野進(jìn)行EPCs 計(jì)數(shù)。

1.3.3 EPCs 黏附功能檢測 使用0.25%的胰酶消化收集培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞， 用EGM-2MV 培養(yǎng)液吹打均勻，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。 將等量EPCs 接種于包被有HFN 的培養(yǎng)板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，然后隨機(jī)選取3 個顯微鏡視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.3.4 EPCs 遷移功能檢測 收集貼壁EPCs 用于制備細(xì)胞懸液，將Transwell 小室（上室與下室間以8.0 μm孔徑的硝酸纖維膜分離開） 每下室分別加入600 μL的EGM-2MV 培養(yǎng)液， 并將100 μL 的EPCs 細(xì)胞懸液加入上室。將加入EPCs 的Transwell 小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，經(jīng)PBS 清洗后，用棉簽去除微孔膜上層的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定已侵入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞，Giemsa 染色后隨機(jī)選擇3 個顯微鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)， 用于評價EPCs 的遷移能力。

1.3.5 EPCs 增殖功能檢測 采用MTT 法檢測EPCs增殖能力。首先制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，將等量的EPCs懸液接種于96 孔板培養(yǎng)， 每孔100 μL 并加入MTT（5 g/L）20 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。 之后取出棄上清液，向每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于微量振蕩器振蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解， 然后置全自動酶標(biāo)儀于波長490 nm 處測定各孔吸收OD 值，用于評價EPCs 增殖能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs 的鑒定

由分離獲取的單個核細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭型。 通過共聚焦顯微鏡鑒定Dil-AcLDL（紅色，激發(fā)波長為543 nm）和FITC-UEA-Ⅰ（綠色，激發(fā)波長為477 nm）雙染色陽性（呈黃色）細(xì)胞即為正在分化的EPCs（圖1，見封三），于倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個視野（倒置熒光顯微鏡，200×）進(jìn)行計(jì)數(shù)并比較。

2.2 APS 對T2DM 患者cEPCs 數(shù)量及黏附功能、遷移功能、增殖功能的影響

兩組患者在治療前cEPCs 的數(shù)量及功能差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；常規(guī)治療組在治療前后cEPCs的數(shù)量及功能無明顯改變（P ＞0.05）；APS 治療組患者經(jīng)過為期2 周的療程后，cEPCs 的數(shù)量顯著增加且cEPCs 各功能均明顯改善，與治療前及常規(guī)治療組治療后比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 治療前后兩組cEPCs 數(shù)量及黏附功能、遷移功能、增殖功能比較（）

表1 治療前后兩組cEPCs 數(shù)量及黏附功能、遷移功能、增殖功能比較（）

注： 與本組治療前比較，*P ＜0.05； 與常規(guī)治療組治療后比較，#P ＜0.05；APS：黃芪多糖；cEPCs：外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞

組別cEPCs 數(shù)量（個/HP）黏附細(xì)胞（個/HP）遷移細(xì)胞（個/HP） 增殖功能APS 治療組（n=36）治療前治療后常規(guī)治療組（n=33）治療前治療后35.16±9.23 46.63±9.22*#17.33±7.52 23.28±8.43*#10.36±9.23 15.96±9.56*#0.323±0.082 0.486±0.085*#34.78±8.09 37.56±9.82 16.98±9.12 18.21±10.79 10.01±7.67 10.43±10.38 0.319±0.073 0.339±0.097

2.3 不良反應(yīng)

兩組患者在研究進(jìn)行過程中，均未有嚴(yán)重不良反應(yīng)。個別患者使用后出現(xiàn)皮膚紅斑、瘙癢、蕁麻疹等過敏反應(yīng)，但短期內(nèi)均可自行消失。

圖1 培養(yǎng)7 d 后EPCs（倒置熒光顯微鏡，200×）

3 討論

近年來T2DM 的發(fā)病率呈逐年增高趨勢，DM 作為一種嚴(yán)重危害人體健康的慢性疾病，已成為世界性公共問題， 其血管病變導(dǎo)致的并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響DM 患者生活質(zhì)量， 并且是DM 患者致死致殘的主要原因。 有相關(guān)報道表明約70%的T2DM 患者死于DM血管并發(fā)癥。 EPCs 是一類能增殖并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞， 可增加缺血組織新生血管形成，并能夠促進(jìn)損傷內(nèi)膜的再內(nèi)皮化，在修復(fù)受損內(nèi)皮并維持正常的內(nèi)皮功能方面起著極為重要的作用。目前已有研究揭示血管內(nèi)皮損傷是DM 血管病變的重要始動環(huán)節(jié)[1]。 而DM 損傷內(nèi)皮功能的主要病理生理學(xué)機(jī)制是高血糖及其氧化代謝產(chǎn)物抑制血管內(nèi)皮NO 生成[4]，抑 制EPCs 分 化 并 促 其 凋 亡[5]，EPCs 受 損后釋放大量炎癥因子介導(dǎo)血管內(nèi)膜的炎性反應(yīng)[6]。

黃芪是由豆科植物蒙古黃芪及膜夾黃芪的干燥塊莖入藥，其味甘，性微溫，歸肺脾二經(jīng)，中醫(yī)治療上具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利尿脫毒以及斂瘡生肌等功效。 作為一味藥用歷史悠久的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，目前臨床上常用于糖尿病、冠心病等慢性疾病的中醫(yī)輔助用藥。APS 是從中藥黃芪中分離提取出來的一種大分子化合物，具有較強(qiáng)的生物活性，是黃芪的主要活性成分之一，具有降低血脂、抗動脈粥樣硬化以及調(diào)控血糖等作用[7-9]。 有相關(guān)動物研究揭示APS 可改善DM 的物質(zhì)代謝以及延緩DM 慢性并發(fā)癥的病程[10]。

徐寒松等[11]在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，一定濃度范圍內(nèi)APS 對DM 患者EPCs 的增殖具有促進(jìn)作用， 且與APS 劑量、使用時間呈依賴關(guān)系，其具體作用機(jī)制可能是通過PI3K/Akt/eNOS 信號途徑達(dá)成[12]。 同時APS能夠促使EPCs 分泌血管內(nèi)皮生長因子[3]參與受損血管內(nèi)皮再生。 提示APS 參與血管內(nèi)皮損傷修復(fù)，并且可以促進(jìn)EPCs 增殖及分化。

本研究通過對比APS 治療組在西藥降糖的基礎(chǔ)上短期加用足療程APS 治療及常規(guī)治療組的單純降糖對癥治療在T2DM 患者中的作用。 研究結(jié)果證實(shí)，短期足療程APS 治療可以顯著增加T2DM 患者cEPCs 的數(shù)量，同時也能夠顯著改善其cEPCs 的黏附能力、遷移能力、增殖能力，與常規(guī)治療相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

綜上所述，血管內(nèi)皮損傷在T2DM 合并血管病變的慢性并發(fā)癥中扮演著重要角色，而T2DM 患者短期足療程使用APS 治療可明顯增加其cEPCs 的數(shù)量且伴隨著cEPCs 功能的顯著改善， 為短期APS 治療在T2DM 患者慢性并發(fā)癥的應(yīng)用上提供了初步依據(jù)。 但APS 改善DM 患者cEPCs 數(shù)量及功能的具體作用機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步的探討和研究。 同時由于本次研究的樣本量相對較少，尚需增加樣本量使研究結(jié)果更確切。

[1] 胡歡歡，衡先培.糖尿病血管內(nèi)皮損傷機(jī)制及防治研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2010，1（1）：68-70.

[2] 沈藝，謝南姿.黃芪甲苷對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外血管生成能力的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（10）：1214-1216.

[3] 先紅，陳玉成.黃芪活性成分（黃芪多糖和黃芪總皂Ⅱ）的促血管生成作用[J].嶺南心血管雜志，2006，12（1）：185-186.

[4] van Ark J，Moser J，Lexis CP，et al.Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers [J]. Diabetologia.2012，55（9）：2501-2512.

[5] Wu J，Lei MX，Xie XY，et al.Rosiglitazone inhibits high glucose-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells through the PI3K/Akt/eNOS pathway[J].Can J Physiol Pharmacol，2009，87（7）：549-555.

[6] Ming XF，Rajapakse AG，Yepuri G，et al.Arginase Ⅱpromotes macrophage inflammatory tesponses through mitochondrial reactive oxygen species，contributing to insulin resistance and atherogenesis[J].J Am Heart Assoc，2012，1（4）：e000992.

[7] Wang YF，Yang XF，Cheng B，et al.Protective effect of Astragalus polysaccharides on ATP binding cassette transporter A1 in THP-1 derived foam cells exposed to tumor necrosis factor-alpha [J]. Phytother Res，2010，24（3）：393-398.

[8] Cheng Y，Tang K，Wu S，et al. Astragalus polysaccharides lowers plasma cholesterol through mechanisms distinct from statins [J]. PLoS One，2011，6（11）：e27437.

[9] Zou F，Mao XQ，Wang N，et al. Astragalus polysaccharides alleviates glucose toxicity and restores glucose homeostasis in diabetic states via activation of AMPK [J]. Acta Pharmacol Sin，2009，30（12）：1607-1615.

[10] 張霞，焦向英.黃芪多糖對2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠作用機(jī)制的研究[J].中國健康月刊，2011，30（2）：8-10.

[11] 徐寒松，雷閩湘，劉澤灝，等.黃芪對人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J].中醫(yī)雜志，2008，49（2）：160-166.

[12] 徐寒松，吳青，謝曉云，等.黃芪多糖對2 型糖尿病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞PI3K/Akt/eNOS 信號通路的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（23）：4272-4276.