劉楊 ，郭沛涌 ，魯貝貝 ，黃偉 ，萬(wàn)禁禁

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院，環(huán)境科學(xué)與工程系，福建 廈門(mén)，361021；2. 華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所，福建 廈門(mén)，361021)

近年來(lái)，水體富營(yíng)養(yǎng)化及其引發(fā)的水華問(wèn)題日益嚴(yán)峻，水體的景觀和生態(tài)功能受到嚴(yán)重影響[1]。在眾多治理水華的研究中，利用化感作用抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)因其可生物降解性和生態(tài)安全性而日益受到重視?；形镔|(zhì)是化感作用的載體，酚酸類(lèi)物質(zhì)是活性較強(qiáng)的一類(lèi)化感物質(zhì)[2]，其中水楊酸、沒(méi)食子酸和兒茶酚普遍存在于多種植物的化感物質(zhì)中，在較低濃度就有較強(qiáng)的化感作用，許多國(guó)外學(xué)者已經(jīng)將其分離并且研究了它們對(duì)藻類(lèi)和其他植物的抑制作用[3-4]。Kamaya等[5-7]的研究結(jié)果表明水楊酸對(duì)幾種綠藻具有明顯的抑制效果。Wang 等[8]證明沒(méi)食子酸等化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。但是，這些研究都是在模擬水體環(huán)境中直接投放酚酸類(lèi)化感物質(zhì)，容易造成局部濃度太高而對(duì)其他生物造成嚴(yán)重影響，并且抑藻的有效時(shí)間也較短。因此，利用具有緩釋功能的抑藻劑來(lái)控制水華藻類(lèi)生長(zhǎng)，可能成為治理水華更有效的方法。殼聚糖(Chitosan)是自然界唯一的堿性多糖，并且是一類(lèi)資源豐富、可生物降解的天然聚合物[9]。梁想等[10]利用甲殼素、殼聚糖等生物載體吸附水溶液中銅離子后對(duì)赤潮生物的殺滅和控制作用，避免了直接投加硫酸銅產(chǎn)生的局部濃度高而傷害魚(yú)類(lèi)的缺點(diǎn)。陳玉成等[11]以殼聚糖作載體合成緩釋性的殼聚糖載銅滅藻劑，能有效控制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，且隨著滅藻劑用量增加，滅藻率增大。同時(shí)，殼聚糖作為吸附劑，對(duì)于水中重金屬和砷等有害物質(zhì)的去除以及凈化水質(zhì)也有了較多的研究[12-14]。綜上所述，酚酸類(lèi)化感物質(zhì)作為抑制劑在抑藻作用機(jī)理方面已經(jīng)有了一定研究，但是還存在抑藻物質(zhì)濃度分部不均和持續(xù)時(shí)間不足的問(wèn)題，而以殼聚糖吸附化感物質(zhì)制備的抑藻劑還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文作者以殼聚糖對(duì)3 種化感物質(zhì)水楊酸、兒茶酚和沒(méi)食子酸的吸附能力研究為切入點(diǎn)，篩選出吸附質(zhì)量比和吸附率較高的組合，制備經(jīng)濟(jì)高效的抑藻劑。利用抑藻劑對(duì)水華微囊藻進(jìn)行長(zhǎng)期的抑制實(shí)驗(yàn)，并以蛋白核小球藻作為對(duì)比，從而為高效、安全的控制藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖，防止和治理水華爆發(fā)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)(FACHB-1028)為水華藻種并且釋放藻毒素，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)(FACHB-9)為蛋白資源藻種，這2 種藻均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，并且分別使用指定培養(yǎng)基：BG11 培養(yǎng)基和Bristol 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將對(duì)數(shù)期的藻種接種到裝有400 mL 新配培養(yǎng)基的 1 L 的錐形瓶中培養(yǎng)，待藻細(xì)胞密度達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分裝到100 mL 經(jīng)過(guò)滅菌的空錐形瓶中，穩(wěn)定1 d 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光暗比為12 h:12 h，每天搖動(dòng)3 次，并隨機(jī)調(diào)換位置，盡量使各瓶的光通量保持一致以減小偶然誤差。

殼聚糖和兒茶酚(鄰苯二酚)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，水楊酸購(gòu)自廣東汕頭市西隴化工，沒(méi)食子酸購(gòu)自華邁科。殼聚糖脫乙酰度＞80%，兒茶酚、水楊酸和沒(méi)食子酸均為分析純。

1.2 殼聚糖對(duì)3 種酚酸類(lèi)化感物質(zhì)吸附能力研究

利用紫外分光光度計(jì)掃描水楊酸、兒茶酚和沒(méi)食子酸3 種酚酸的吸收光譜，檢測(cè)出吸收峰，然后繪制濃度吸光度相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.05 g 殼聚糖分別加入20 mL 初始濃度為100，200，300，400，500，600，800，1 000，1 200 和1 500 mg/L 的3 種酚酸溶液中，然后在25 ℃水浴恒溫振蕩l h 后濾后，在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度計(jì)算溶液中未被吸附的酚酸的濃度，并計(jì)算酚酸類(lèi)物質(zhì)和殼聚糖的吸附比和吸附率。吸附結(jié)果如下：殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附率最高，沒(méi)食子酸濃度為1 000 mg/L 時(shí)，吸附率可以達(dá)到85.7%，對(duì)應(yīng)吸附比為491 mg/g。殼聚糖對(duì)水楊酸和兒茶酚的最高吸附率分別為43.3%和14.5%，對(duì)應(yīng)吸附比分別為138 mg/g 和46 mg/g，吸附效果相對(duì)較差，所以選取沒(méi)食子酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑的制備

分別研究沒(méi)食子酸溶液初始濃度、殼聚糖初始用量、吸附時(shí)間和溫度等單因子條件下殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸吸附效果的影響，以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，利用殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附率和吸附比作為響應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行因子重要性排序，并找出吸附比較高的最優(yōu)組合。

1.4 抑藻劑對(duì)沒(méi)食子酸解析能力分析

在最優(yōu)條件下合成殼聚糖載沒(méi)食子酸后，過(guò)濾并將沉淀在25 ℃下真空干燥24 h 即制得抑藻劑。在100 mL 蒸餾水的錐形瓶中分別加入抑藻劑，使其濃度為6，10，20，30，60，90 和130 mg，在與藻類(lèi)培養(yǎng)相同條件下，于0.2，1，3，10，24 和48 h 吸取上清液，過(guò)0.45 μm 濾膜后測(cè)定吸光度，計(jì)算沒(méi)食子酸含量，以研究殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑用量對(duì)沒(méi)食子酸釋放的影響。

1.5 殼聚糖、沒(méi)食子酸和抑藻劑對(duì)2 種淡水微藻生長(zhǎng)的影響

根據(jù)抑藻劑中殼聚糖與沒(méi)食子酸的比例，設(shè)置m(殼聚糖):m(沒(méi)食子酸):m(抑藻劑)為2:1:3。(1) 直接投加相應(yīng)質(zhì)量物質(zhì)分別到100 mL 處于對(duì)數(shù)期的水華微囊藻液中(葉綠素a 含量為1 000 μg/L 左右)，設(shè)置最終質(zhì)量濃度分別4，6，14，20，40，60 和87 mg/L 的殼聚糖處理組，2，3，7，10，20，30 和43 mg/L 的沒(méi)食子酸處理組和6，10，20，30，60，90 和130 mg/L的抑藻劑處理組，60 mg/L 的沒(méi)食子酸為相對(duì)抑藻劑抑制時(shí)間做的對(duì)照，空白對(duì)照組為ck，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣，每隔1 d 測(cè)量一次葉綠素a 的含量。(2) 直接投加相應(yīng)質(zhì)量物質(zhì)分別到100 mL 處于對(duì)數(shù)期的蛋白核小球藻液中(葉綠素a 含量為1 000 μg/L 左右)，設(shè)置最終質(zhì)量濃度分別為4，6，14，20，30，40 和60 mg/L的殼聚糖處理組，2，3，7，10，15，20，30 和43 mg/L的沒(méi)食子酸處理組和6，10，20，30，45，60，90 和130 mg/L 的抑藻劑處理組，空白對(duì)照組為ck，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣，每隔2 d 測(cè)量一次葉綠素a 的含量，以抑制率為響應(yīng)指標(biāo)，觀察抑藻劑用量隨時(shí)間變化對(duì)滅藻效果的影響。

抑藻劑的藥效期，一般考慮在加入15 d 后藻細(xì)胞不再增長(zhǎng)時(shí)，藥效期為長(zhǎng)；加入抑藻劑后15 d 內(nèi)藻細(xì)胞又開(kāi)始增長(zhǎng)時(shí)，則藥效期較短[15]。持續(xù)觀測(cè)15 d 內(nèi)抑制率的變化，確定抑藻劑長(zhǎng)效抑藻的有效用量。

由于抑藻劑、殼聚糖在藻液中成為懸浮顆粒，無(wú)法通過(guò)吸光度來(lái)表征藻類(lèi)的生長(zhǎng)情況，并且傳統(tǒng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法存在人為誤差較大，而葉綠素是藻類(lèi)進(jìn)行光合作用的條件之一，關(guān)乎藻類(lèi)是否能夠順利通過(guò)光合作用積累有機(jī)物和生長(zhǎng)繁殖。葉綠素a 屬于葉綠素的一種，其含量的高低可反映出藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用的速率以及藻類(lèi)生長(zhǎng)情況，并且藍(lán)藻和綠藻中都存在葉綠素a，因此，可以通過(guò)測(cè)定葉綠素a 含量來(lái)評(píng)價(jià)抑藻劑、沒(méi)食子酸和殼聚糖對(duì)2 種藻類(lèi)的影響。葉綠素 a 含量采用浮游植物分析儀(Phyto-PAM Phytoplankton Analyzer，德國(guó)walz 公司)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

(1) 殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附量公式如下

式中：Q 為對(duì)沒(méi)食子酸的吸附量(mg)；ρ原為初始沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)；ρ殘吸附后溶液中殘余的沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)；V 為沒(méi)食子酸溶液體積(mL)。

(2) 殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附比公式如下：

式中：P 為殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附比(mg/g)；m 為投加殼聚糖的質(zhì)量(g)。

(3) 抑藻率的計(jì)算公式為：

式中：I 為抑制率；ρ對(duì)照組為對(duì)照組葉綠素含量(μg/L)；ρ處理組為處理組葉綠素含量(μg/L)。

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin8.0 進(jìn)行作圖。葉綠素a 含量采用重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑的制備

殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的單因子試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)沒(méi)食子酸濃度為變量時(shí)，吸附比隨著沒(méi)食子酸始濃度的升高而增加，增加速度先快速再趨于平緩，吸附率變化范圍較大，并且在沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度1 000 mg/L時(shí)達(dá)到最大值85.76%；當(dāng)殼聚糖用量為變量時(shí)，吸附比變化較大，并隨著殼聚糖用量的增加而逐漸降低，吸附率先快速上升，在0.06 g 時(shí)取得最大值86.12%，而后緩慢降低到81.48%，這可能是由于殼聚糖過(guò)多，震蕩力不足而使殼聚糖在溶液中相互影響而造成的；當(dāng)吸附溫度為變量時(shí)，吸附量隨著溫度的升高而降低，最佳吸附溫度為25 ℃；當(dāng)吸附時(shí)間為變量時(shí)，吸附量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，前30 min 增長(zhǎng)速率快，而后增速減緩。

正交試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，以吸附比和吸附率為響應(yīng)指標(biāo)，首先考慮吸附比較大的組合3 和4，再考慮到組合3 的吸附率很低只有25.24%，而組合4 的吸附率較高，為51.94%，因此選擇組合4 為最佳吸附組合。殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的最優(yōu)條件為：20 mL 沒(méi)食子酸溶液中殼聚糖用量是0.02 g，溫度為25 ℃，吸附時(shí)間為60 min，沒(méi)食子酸初始質(zhì)量濃度為1 200 mg/L，在該條件下可獲得623.095 mg/g 的吸附比。

吸附后濾液的循環(huán)使用：根據(jù)最佳吸附條件制備的殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑，其濾液中殘余的沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為659.6 mg/L，此時(shí)濾液體積約為100 mL，再向?yàn)V液中溶解54.04 mg 的沒(méi)食子酸可使溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1 200 mg/L，則可作為抑藻劑的原料，使濾液循環(huán)利用。但是沒(méi)食子酸在水中溶解氧存在情況下，易自養(yǎng)化生成物質(zhì)可能會(huì)對(duì)吸附造成影響。在擴(kuò)大抑藻劑制備時(shí)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證濾液的重復(fù)使用次數(shù)。

表1 殼聚糖吸附?jīng)]食子酸實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results of adsorption capacity of Gallic acid by CTS

2.2 抑藻劑對(duì)沒(méi)食子酸解析能力

不同抑藻劑的用量對(duì)沒(méi)食子酸量釋放后濃度的影響，如圖1 所示，抑藻劑質(zhì)量濃度分別為6，10，20，30，60，90 和130 mg/L 時(shí)，在投加初期釋放濃度上升趨勢(shì)較快，釋放率在24 h 時(shí)達(dá)到最大值，分別為79.26%，90.80%，70.44%，84.34%，59.43%，48.46%和43.56%。隨著抑藻劑投加質(zhì)量增加，沒(méi)食子酸釋放濃度逐漸升高，釋放率呈現(xiàn)整體降低的趨勢(shì)，這說(shuō)明溶液中溶解的沒(méi)食子酸阻礙了抑藻劑中沒(méi)食子酸的釋放，當(dāng)吸附與解析到達(dá)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，沒(méi)食子酸濃度穩(wěn)定；當(dāng)溶液中沒(méi)食子酸自氧化之后，抑藻劑會(huì)釋放一部分沒(méi)食子酸，而達(dá)到新的平衡。此外，抑藻劑投加于水體之后，會(huì)浮于水面，釋放時(shí)間足夠其較均勻的分布，不會(huì)造成局部濃度過(guò)高。

圖1 殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑的用量對(duì)解吸的影響Fig.1 Effect of dosage of CTS-GA on desorption

2.3 殼聚糖、沒(méi)食子酸和抑藻劑對(duì)水華微囊藻生長(zhǎng)的影響

殼聚糖對(duì)水華微囊藻的影響如圖2(a)和(b)所示?？梢?jiàn)，處理組與對(duì)照組沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異(p＞0.05)。殼聚糖呈粉末狀態(tài)并且在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的震蕩培養(yǎng)，所以殼聚糖對(duì)藻類(lèi)的絮凝作用表現(xiàn)不明顯。不同質(zhì)量殼聚糖的抑藻率在20%內(nèi)波動(dòng)，表現(xiàn)出較弱的抑制作用。這表明殼聚糖對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)影響不明顯，藻類(lèi)的生長(zhǎng)對(duì)殼聚糖沒(méi)有投加量的依賴性。

沒(méi)食子酸對(duì)水華微囊藻的影響如圖2(c)和(d)所示?？梢?jiàn)，抑制率隨沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度的升高而升高。當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為2，3 和7 mg/L 時(shí)，抑制作用相對(duì)較弱；當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為10，20 和30 mg/L時(shí)，抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)效抑藻；當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為43 mg/L 時(shí)，2 d 后抑藻率可達(dá)90%以上，持續(xù)到到觀測(cè)的第16 d 抑藻率仍能維持在接近100%，但是16 d 之后，葉綠素a 含量表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，說(shuō)明沒(méi)食子酸在該使用濃度下，于16 d后被消耗分解，濃度不足以抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)而表現(xiàn)出藻類(lèi)恢復(fù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)；當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為60 mg/L，抑制時(shí)間在略早于24 d時(shí)，藻類(lèi)表現(xiàn)出恢復(fù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，這說(shuō)明高濃度的投加量仍不適合進(jìn)行長(zhǎng)期抑藻。

圖2 CTS，GA 和CTS-GA 對(duì)水華微囊藻生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of CTS, Gallic acid and CTS-Gallic acid on growth of Microcystis flos-aquae

抑藻劑對(duì)水華微囊藻的抑制效果如圖2(e)和(f)所示。可見(jiàn)，抑制效率隨抑藻劑使用濃度的升高而升高。6 mg/L 的抑藻劑處理組與對(duì)照組ck 相比差異性不顯著(p＞0.05)，其他濃度處理組能顯著(p＜0.05)抑制微囊藻的生長(zhǎng)。當(dāng)抑藻劑質(zhì)量濃度為10 和20 mg/L 時(shí)，抑藻率先升高后降低，不能有效滅殺藻細(xì)胞；抑藻劑的質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/L 時(shí)，2 d 后抑藻率可達(dá)90%以上，5 d 后接近100%，持續(xù)到16 d 抑藻率仍可達(dá)90%以上，但到了第24 d 抑制率下降到80%以內(nèi)，說(shuō)明16 d 后抑藻劑沒(méi)食子酸釋放殆盡，溶液中的沒(méi)食子酸被分解消耗，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行藻類(lèi)抑制；當(dāng)抑藻劑質(zhì)量濃度為60，90 和130 mg/L 時(shí)，3 d 后抑藻率可達(dá)90%以上，5 d 后可接近100%，到觀測(cè)的第24 d，抑藻率仍能維持在接近100%，說(shuō)明殼聚糖載沒(méi)食子酸抑藻劑在該使用濃度下能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的抑藻率。這是因?yàn)闅ぞ厶菍?duì)沒(méi)食子酸的吸附對(duì)沒(méi)食子酸起到了保護(hù)的作用而防止了其同時(shí)發(fā)生自氧化而被進(jìn)一步消耗。以上結(jié)果表明：抑藻劑質(zhì)量濃度在30 mg/L以上時(shí)抑藻時(shí)間可持續(xù)15 d；當(dāng)抑藻劑質(zhì)量濃度在60 mg/L 以上時(shí)抑制時(shí)間可長(zhǎng)于24 d。

2.4 殼聚糖、沒(méi)食子酸和抑藻劑對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

殼聚糖對(duì)蛋白核小球藻的影響如圖3(a)所示，殼聚糖對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)影響不顯著(p＞0.05)，未因絮凝作用而降低小球藻的總?cè)~綠素a 含量，所投加濃度梯度殼聚糖對(duì)小球藻的影響沒(méi)有表現(xiàn)出抑制的變化趨勢(shì)，說(shuō)明小球藻的生長(zhǎng)對(duì)殼聚糖的投加量沒(méi)有依賴性。沒(méi)食子酸對(duì)蛋白核小球藻的影響如圖3(b)所示，沒(méi)食子酸在低濃度的投加量下沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的(p＞0.05)抑制作用，當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為43 mg/L 時(shí)，前3 d 并未表現(xiàn)出明顯的抑制，但是隨著沒(méi)食子酸的自氧化，大量抑藻物質(zhì)生成，抑制率在隨后幾天表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，在9 d 達(dá)到最高值為14%，但是抑藻物質(zhì)隨后又被消耗，在13 d 和15 d 時(shí)抑制率分別下降到12%和11%。這表明在相對(duì)于可以強(qiáng)烈抑制水華微囊藻生長(zhǎng)的沒(méi)食子酸濃度對(duì)蛋白核小球藻的抑制作用不明顯。抑藻劑對(duì)蛋白核小球藻的影響如圖3(c)所示。由圖3 可見(jiàn)：抑藻劑處理組與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)，當(dāng)抑藻劑質(zhì)量濃度為60，90 和130 mg/L時(shí)對(duì)蛋白核小球藻的抑制率在5%以內(nèi)，而這3 個(gè)濃度卻可以顯著抑制水華微囊藻的生長(zhǎng)，說(shuō)明抑藻劑的釋放沒(méi)食子酸形成的濃度不足以抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，對(duì)蛋白核小球藻表現(xiàn)出生態(tài)安全性。

圖3 CTS，GA 和CTS-GA 對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of CTS, Gallic acid and CTS-Gallic acidon growth of Chlorella pyrenoidosa

2.5 按投加比例分組比較對(duì)水華微囊藻生長(zhǎng)的影響

按照不同梯度抑藻劑中相應(yīng)所含殼聚糖和沒(méi)食子酸的量分別作圖進(jìn)行比較，如圖4 所示。圖4 中ck代表對(duì)照空白，y 代表抑藻劑，k 代表殼聚糖，m 代表沒(méi)食子酸。由圖4(a)可見(jiàn)：抑藻劑的釋放沒(méi)食子酸速率較慢，抑制率比直接在藻液中投加沒(méi)食子酸要低，其釋放量不足以明顯抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)；由圖4(b)可見(jiàn)：抑藻劑較直接投加沒(méi)食子酸表現(xiàn)出較好的抑制效率，但是投加初期，直接投加沒(méi)食子酸使其同時(shí)被消耗分解，所以后期抑制率降低。而抑藻劑呈現(xiàn)緩慢釋放，可以較長(zhǎng)時(shí)間抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)，但是由于投加量較低，釋放量不足以明顯抑藻；由圖4(c)可見(jiàn)：沒(méi)食子酸加入初期表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是之后與圖4(b)所示的趨勢(shì)相同，表明此濃度下的沒(méi)食子酸不能完全抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)。而抑藻劑表現(xiàn)出持續(xù)的抑藻效果，但是釋放速度較慢釋放量還是不足以完全抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)；由圖4(d)可見(jiàn)：沒(méi)食子酸加入初期表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是到了第10 d 后，隨著沒(méi)食子酸的消耗，抑制率降低，表明沒(méi)食子酸不能持續(xù)抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)。而抑藻劑對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制效果，12 d 內(nèi)幾乎將葉綠素質(zhì)量濃度維持在200 μg/L 以內(nèi)，但是16 d 之后隨著抑藻劑釋放以及消耗，藻類(lèi)又呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；圖4(e)和(f)所示沒(méi)食子酸的抑藻效果與圖4(d)所示的相似，初期有較好的抑藻效果，分別在第5 d 和第10 d 之后抑制率變低，藻類(lèi)恢復(fù)增長(zhǎng)。而抑藻劑都表現(xiàn)出持續(xù)的抑藻效果，在24 d 內(nèi)將葉綠素a 的質(zhì)量濃度維持在25 μg/L 內(nèi)，曲線呈平緩的趨勢(shì)，抑藻劑的抑制時(shí)間可長(zhǎng)于24 d。

3 討論

3.1 抑藻劑中殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的制備以及解析

殼聚糖未經(jīng)溶解和改性便可用于沒(méi)食子酸的吸附，并且具有較高的吸附量和吸附效率，簡(jiǎn)化了抑藻劑的制備過(guò)程，而且吸附過(guò)程在常溫等簡(jiǎn)單條件下就可以進(jìn)行。抑藻劑在室溫25 ℃下，貯存期為1.5～2 a[17]，這對(duì)抑藻劑的大量生產(chǎn)以及使用期限提供了保障。

圖4 CTS-GA 以及GA 和CTS 對(duì)水華微囊藻葉綠素a 含量的影響Fig.4 Effects of CTS-GA, GA and CTS on Chlorophyll a content of Microcystis flos-aquae

抑藻劑制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附容量很大，吸附量隨著沒(méi)食子酸濃度的升高而升高。這說(shuō)明，一定量殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附量依賴于溶液沒(méi)食子酸的濃度，當(dāng)殼聚糖吸附到?jīng)]食子酸上的速度等于沒(méi)食子酸從殼聚糖上解析下來(lái)的速度時(shí)，殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附達(dá)到平衡，此時(shí)過(guò)濾便可得到相應(yīng)吸附量的抑藻劑。這說(shuō)明殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程。殼聚糖分子中存在大量孔隙可以直接吸附?jīng)]食子酸，并且這種吸附容易釋放，所以在釋放實(shí)驗(yàn)中24 h 便可達(dá)到較高的濃度，足以抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)；殼聚糖分子中的大量羥基和氨基也可以與沒(méi)食子酸生成化學(xué)鍵，這種吸附不容易釋放[18]，所以抑藻劑可以緩慢釋放沒(méi)食子酸進(jìn)行長(zhǎng)期抑藻。沒(méi)食子酸與殼聚糖的結(jié)合部位在沒(méi)食子酸的羧酸基與殼聚糖的氨基之間形成的酰胺鍵或與羥基之間形成的酯鍵[19]。抑藻實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附起到保護(hù)作用而防止其發(fā)生自氧化而同時(shí)被降解消耗，從而達(dá)到了長(zhǎng)期抑藻的效果，解決了直接投加沒(méi)食子酸而造成的抑制時(shí)間不足的問(wèn)題。

3.2 抑藻劑所釋放出的沒(méi)食子酸的抑藻機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)研究了抑藻劑對(duì)水華微囊藻和蛋白核小球藻的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)：抑藻劑對(duì)水華微囊藻具有一定的抑制效應(yīng)，且隨著濃度的增加抑制效果越明顯。抑藻劑釋放沒(méi)食子酸到培養(yǎng)基后，可能被藻細(xì)胞產(chǎn)生的抗性物質(zhì)降解，或作為碳源被藻細(xì)胞吸收代謝。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其在培養(yǎng)基中的濃度勢(shì)必會(huì)逐漸下降，當(dāng)降低到一定濃度時(shí)則不能有效抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，致使抑制率下降[20-21]?；衔锝Y(jié)構(gòu)研究顯示沒(méi)食子酸的細(xì)胞毒作用不是酚類(lèi)化合物所共有的，而是依賴于沒(méi)食子酸結(jié)構(gòu)上特有的特征：3 個(gè)相鄰的酚羥基是主要的活性基團(tuán)[22]。因此，沒(méi)食子酸具有較強(qiáng)抑制作用，且效果快，通過(guò)進(jìn)一步的室外實(shí)驗(yàn)和生態(tài)安全評(píng)價(jià)，可望開(kāi)發(fā)成長(zhǎng)效的抑藻劑。

還有研究表明：沒(méi)食子酸的酚羥基，在過(guò)渡金屬離子如Cu2+和Fe3+存在時(shí)，自氧化可能是其化感作用的主要機(jī)制，且在一定的濃度下，氧化產(chǎn)物的抑制作用大于它本身對(duì)藻類(lèi)的抑制作用[23]。進(jìn)一步研究表明：在過(guò)渡金屬離子存在時(shí)，酚酸自氧化可誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2和醌，H2O2可進(jìn)一步造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化[24]；醌則作為潛在的過(guò)氧化物，可通過(guò)氧化還原循環(huán)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而危害細(xì)胞的生長(zhǎng)[25]。酚酸的自氧化與其苯環(huán)上羥基的位置和數(shù)量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用的Bristol 和BG11 培養(yǎng)基中含有一定量的Cu2+和Fe3+，在自然水體中一般也含有Cu2+和Fe3+，因而滿足酚酸自氧化的條件。加入抑藻劑或沒(méi)食子酸之后，隨著時(shí)間的推移，低濃度溶液中的沒(méi)食子酸逐漸自氧化，產(chǎn)生的醌類(lèi)氧化產(chǎn)物對(duì)水華微囊藻具有更強(qiáng)的抑制作用。最后，氧化產(chǎn)物被消耗，濃度不足以對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致其抑制率降低。

3.3 抑藻劑對(duì)2 種藻生長(zhǎng)的影響

水華微囊藻屬于藍(lán)藻為原核生物，其細(xì)胞壁主要成分肽聚糖，并且無(wú)葉綠體。蛋白核小球藻屬于綠藻為真核生物，其細(xì)胞壁堅(jiān)韌主要成分為纖維素，并且有葉綠體。本文中，高濃度沒(méi)食子酸對(duì)水華微囊藻的抑制率在95%以上，而對(duì)蛋白核小球藻的抑制率卻不足10%，正是由于藍(lán)藻綠藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的不同所造成的影響效果差異。Zhu 等[26]研究了沒(méi)食子酸對(duì)藍(lán)藻銅綠微囊藻和綠藻羊角月牙藻的影響，其結(jié)果表明24 h后2.65 mg/L 的沒(méi)食子酸造成銅綠微囊藻光系統(tǒng)II 和整個(gè)電子傳遞鏈活動(dòng)的顯著減少，分別為70.95%和40.77%(P＜0.05)，但是對(duì)羊角月牙藻沒(méi)有抑制效果。這與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明了藍(lán)藻中光系統(tǒng)Ⅱ是酚酸類(lèi)化感物質(zhì)的一個(gè)攻擊位點(diǎn)。同時(shí)，沒(méi)食子酸能有效抑制塔瑪亞歷山大藻的生長(zhǎng)，破壞藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制藻細(xì)胞的正常分裂活動(dòng)[27]。塔瑪亞歷山大藻屬于甲藻，有學(xué)者認(rèn)為它是介于原核生物與真核生物之間的間核生物。這表明沒(méi)食子酸對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)藻類(lèi)的化感作用機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1) 殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸的吸附受到?jīng)]食子酸初始濃度、殼聚糖用量、溫度以及吸附時(shí)間等因素的影響，殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的最優(yōu)條件為20 mL 的沒(méi)食子酸溶液中殼聚糖用量為0.02 g，溫度為25 ℃，吸附時(shí)間為60 min，沒(méi)食子酸初始質(zhì)量濃度為1 200 mg/L。

(2) 抑藻劑其解吸狀況受抑藻劑的用量和解析時(shí)間的影響，表現(xiàn)出了緩釋效果，并且殼聚糖對(duì)沒(méi)食子酸起到保護(hù)的作用而防止其降解，延長(zhǎng)了等量的沒(méi)食子酸的使用時(shí)間。

(3) 抑藻劑對(duì)于水華微囊藻的有效用量在 30 mg/L 以上，當(dāng)用量在60 mg/L 以上時(shí)抑制時(shí)間可長(zhǎng)于24 d，屬于長(zhǎng)效滅藻劑。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑藻劑對(duì)于蛋白核小球藻沒(méi)有表現(xiàn)出明顯抑制效果，表現(xiàn)出對(duì)真核藻類(lèi)的生態(tài)安全性。

[1] Klemas V. Remote sensing of algal blooms: An overview with case studies[J]. Journal of Coastal Research, 2012, 28(1A):34-43.

[2] LI Zhaohui, WANG Qiang, RUAN Xiao, et al. Phenolics and plant allelopathy[J]. Molecules, 2010, 15(12): 8933-8952.

[3] John J, Sarada S. Role of phenolics in allelopathic interactions[J].Allelopathy Journal, 2012, 29(2): 215-229.

[4] Mitrovic M, Jaric S, Djurdjevic L, et al. Allelopathic and Environmental implications of plant phenolic compounds[J].Allelopathy Journal, 2012, 29(2): 177-197.

[5] Kamaya Y, Tsuboi S, Takada T, et al. Growth stimulation and inhibition effects of 4-hydroxybenzoic acid and some related compounds on the freshwater green alga Pseudokirchneriella subcapitata[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2006, 51(4): 537-541.

[6] Kovacik J, Klejdus B, Hedbavny J, et al. Effect of copper and salicylic acid on phenolic metabolites and free amino acids in Scenedesmus quadricauda(Chlorophyceae)[J]. Plant Science,2010, 178(3): 307-311.

[7] Raman V, Ravi S. Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on antioxidant systems of Haematococcus pluvialis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2011, 33(3): 1043-1049.

[8] WANG Hongqiang, WU Zhengbin, ZHANG Shenghua.Relationship between the allelopathic activity and molecular structure of hydroxyl derivatives of benzoic acid and their effects on cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Allelopathy Journal, 2008, 22(1): 205-211.

[9] Pillai C K S, Paul W, Sharma C P. Chitin and chitosan polymers:Chemistry, solubility and fiber formation[J]. Progress In Polymer Science, 2009, 34(7): 641-678.

[10] 梁想, 尹平河, 趙玲, 等. 生物載體除藻劑去除海洋赤潮藻[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2001, 121(1): 15-17.LIANG Xiang, YIN Pinghe, ZHAO Ling, et al. Removing red tide algea in the sea by biomass carrier as algaecide[J]. China Environmental Science, 2001, 121(1): 15-17.

[11] 陳玉成, 楊志敏, 李洪亮. 殼聚糖載銅滅藻劑對(duì)Chlorella pyrenoidosa 的去除[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(8): 1653-1659.CHEN Yucheng, YANG Zhimin, LI Hongliang. Removal of chlorella pyrenoidosa by copper-chitosan algaecide[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2011, 31(8): 1653-1659.

[12] Gerente C, Lee V K C, Le C P, et al. Application of chitosan for the removal of metals from wastewaters by adsorption:Mechanisms and models review[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2007, 37(1): 41-127.

[13] Ngah W S W, Teong L C, Hanafiah M A K M. Adsorption of dyes and heavy metal ions by chitosan composites: A review[J].Carbohydrate Polymers, 2011, 83(4): 1446-1456.

[14] Ludovico P, Massimiliano F. Use of chitosan and chitosanderivatives to remove arsenic from aqueous solutions[J].Carbohydrate Research, 2012, 356: 86-92.

[15] 李星, 趙亮, 楊艷玲. 錳銅復(fù)合除藻劑滅活銅綠微囊藻效能研究[J]. 北京理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(10): 910-913.LI Xing, ZHAO Liang, YANG Yanling. A study on the inactivation of Microcystis Aeruginosa by manganese-copper composite algaecide[J]. Transactions of Beijing Institute of Technology, 2009, 29(10): 910-913.

[16] WANG Zhicong, LI Dunhai, QIN Hongjie, et al. An integrated method for removal of harmful cyanobacterial blooms in eutrophic lakes[J]. Environmental Pollution, 2012, 160(1):34-41.

[17] 郭滿滿, 肖卓炳, 彭密軍, 等. 沒(méi)食子酸的熱穩(wěn)定性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2012, 32(4): 58-62.GUO Manman, XIAO Zhuobing, PENG Mijun, et al. Thermal stability of gallic acid[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2012, 32(4): 58-62.

[18] Cigdem Y, Gokce S K, Yesim A, et al. Gallic acid-loaded chitosan nanoparticles: A preliminary study[J]. European Biotechnology Congress, 2011, 22(1): 127-133.

[19] Wanvimol P, Garry R B, Suwabun C. Chitosan gallate as a novel potential polysaccharide antioxidant: An EPR study[J].Carbohydrate Research, 2010, 345(1): 132-140.

[20] Poulson K L, Sieg R D, Prince E K, et al. Allelopathic compounds of a red tide dinoflagellate have species-specific and context-dependent impacts on phytoplankton[J]. Marine Ecology Progress Series, 2010, 416: 69-78.

[21] JIANG Dan, HUANG Lingfeng, LIN Shiquan, et al. Allelopathic effects of euhalophyte Salicornia bigelovii on marine alga Skeletonema costatum[J]. Allelopathy, 2010, 25(1): 163-172.

[22] Inoue M, Suzuki R, Sakaguchi N, et al. Selective induction of cell death in cancer cells by gallic acid[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1995, 18(11): 1526-1530.

[23] Nakai S, Inoue Y, Hosomi M, et al. Myriophyllum spicatumreleased allelopathic polyphenols inhibiting growth of blue-green algae Microcystis aeruginosa[J]. Water Research, 2000, 34(11):3026-3032.

[24] Ayako F, Shinkji O, Mariko M, et al. (-)-Epigallocatechin gallate causes oxidative damage to isolated and cellular DNA[J].Biochemical Phamacology, 2003, 66(9): 1769-1778.

[25] Wolf B, Christa M, Kurt S. Electron paramagnetic resonance studies of radical species of proanthocyanidins and gallate esters[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2000, 374(2):347-355.

[26] ZHU Junying, LIU Biyun, WANG Jing, et al. Study on the mechanism of allelopathic influence on cyanobacteria and chlorophytes by submerged macrophyte (Myriophyllum spicatum)and its secretion[J]. Aquatic Toxicology, 2010, 98(2): 196-203.

[27] 楊維東, 張信連, 劉潔生. 酚酸類(lèi)化感物質(zhì)對(duì)塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2005, 25(4): 417-419.YANG Weidong, ZHANG Xinlian, LIU Jiesheng. The influence of allelochemicalo on the growth of Alexandrium tamarense[J].China Environmental Science, 2005, 25(4): 417-419.