屈鵬飛 李浩波 陳彪 賈志宇 趙云轉(zhuǎn) 張睿 楊威 張英懷

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性的炎癥性疾病，其特征為破骨細胞介導的骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)軟骨的破壞［1］。甲氨蝶呤(MTX)是一個單甲基的氨基蝶呤，近年來被廣泛地使用，是最有效的治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的臨床藥物之一。甲氨蝶呤和氨基蝶呤由于能夠通過抑制一種控制核酸合成的酶(二氫葉酸還原酶)來抑制DNA合成，因此在抗腫瘤的方面，也有著非常顯著的藥效［2］。近年來在對類風濕性關(guān)節(jié)炎的患者治療過程中，低劑量的甲氨蝶呤被廣泛的用來抑制關(guān)節(jié)炎癥［3］，但是最近的研究表明，甲氨蝶呤在一些類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療過程中，出現(xiàn)了效果不良，并且可能是因為給藥過程中，因為其拮抗劑的潛在可能，而導致了效能極大降低［4，5］。本研究主要是在大鼠的全骨髓細胞的培養(yǎng)體系中脫氧腺苷與甲氨蝶呤的拮抗現(xiàn)象和在佐劑引導的關(guān)節(jié)炎動物試驗模型中腺苷脫氨酶水平的變化來初步研究甲氨蝶呤對腺苷脫氨酶的抑制現(xiàn)象，并通過目前的證據(jù)發(fā)現(xiàn)腺苷脫氨酶可能為甲氨蝶呤的一個分子靶，并以此來解釋在類風濕關(guān)節(jié)炎治療過程中，造成甲氨蝶呤治療效果不良的形成機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物4周齡SD雄性大鼠(清潔級，體重100～120 g)和5周齡雌性Lewis大鼠(清潔級，體重100～120 g)，由九動株式會社(鳥棲，日本)提供，所有的動物試驗都是根據(jù)九州大學制定的護理和使用動物指南而進行的。

1.2 主要試劑及儀器 α-Minimum Essential Medium(αMEM;cat#12000-022)胎牛血清和青霉素購于Invitrogen公司(大島，紐約)。1，25-(OH)2D3購于英國普利茅斯生物研究實驗室。腺苷脫氨酶抗體(H-300):SC-25747購于圣克魯斯生物技術(shù)(美國加利福尼亞州圣克魯斯)。第二抗體:Alexa Fluor?488 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)和(ECL)試劑盒購于Technologies Corporation(東京，日本)。甲氨蝶呤，脫氧核苷和免疫染色試劑盒購于美國Sigma公司。Kat1表面抗體由九州大學口腔分子解剖學實驗室提供。

1.3 骨髓培養(yǎng)系統(tǒng) 全骨髓細胞培養(yǎng)系(破骨細胞形成系):將4周齡SD雄性大鼠用異氟烷麻醉后，無菌條件下取其脛骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，然后用25號注射針沖出全骨髓細胞，調(diào)整細胞濃度，用24孔培養(yǎng)板(1×106cells/孔)或10 cm培養(yǎng)皿(3.85×106cells/皿)，在37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15%FBS的α-MEM培養(yǎng)液。其中要添加1α，25-二羥維生素D3的濃度為10-8mol(V/V)，加熱處理ROS17/2.8細胞培養(yǎng)基(HT-ROS CM)濃度為10%。培養(yǎng)4或5 d后，進行Kat1免疫染色，其中含有3個以上的核的Kat1陽性細胞作為破骨細胞樣多核細胞進行計數(shù)。

1.4 免疫染色 全骨髓細胞培養(yǎng)5 d后，用α-MEM培養(yǎng)液沖洗兩次:(1)一抗:每孔加入1/100的Kat1抗體(10 μg/ml)200 μl。(2)于37℃培養(yǎng)30 min后，PBS沖洗3次，4%的甲醛溶液固定20 min。(3)用PBS洗4次，加入3%羊血清，室溫靜置30 min。(4)二抗:移除羊血清，直接加入生物素基化抗體小鼠IgM，室溫靜置30 min。(5)用PBS清洗6次后，加入發(fā)光劑ABCAP(30 min前預制)，遮光室溫放置30 min。(6)用PBS清洗6次，然后加入CDR(溶于0.1 mol/L Tris-Hcl緩沖液的1 mmol/L左旋咪唑)，遮光室溫放置30 min后，用PBS沖洗3次，加入5%的戊二醛，再靜置30 min。(7)蒸餾水清洗4次，室溫下干燥后，高倍顯微鏡下觀察計數(shù)，細胞核超過3個的染色陽性細胞為破骨細胞。

1.5 關(guān)于Lewis大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的誘導 實驗對象:12只5周齡雌性Lewis大鼠被分為3組。(1)第1組(對照組):大鼠尾根部行皮下單獨注射礦物油，0.5 ml/只。(2)第2組(關(guān)節(jié)炎組):①大鼠尾根部行皮下注射弗氏佐劑(CFA)為25 mg/kg熱滅活M.酪酸;并以礦物油作注射介質(zhì);②同時用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)行腹腔注射，腹腔注射于佐劑皮下注射后第3天開始，1次/周。(3)第3組(治療組):①首先與關(guān)節(jié)炎組一樣在大鼠尾根部行皮下注射弗氏佐劑(CFA)為25 mg/kg并以礦物油作注射介質(zhì);②同時以甲氨蝶呤(1 mg·kg-1·周-1)行腹腔注射，腹腔注射于佐劑皮下注射后第3天開始，1次/周。4周后，所有的后踝關(guān)節(jié)(含有脛骨遠端和距骨)被用來制作石蠟切片并行免疫熒光染色。

1.6 免疫熒光染色(1)石蠟切片(6 μm)脫蠟后，先用10%山羊血清于室溫下進行封閉60分鐘。(2)切片用(H-300)抗-ADA多克隆抗體(H-300，抗體需用1%山羊血清1∶200稀釋)孵育，并置于4℃的濕盒內(nèi)過夜。(3)切片用PBS清洗6次后，加入與Alexa熒光?488聯(lián)結(jié)的第二抗體goat anti-rabbit IgG(H+L)(A11034，抗體需用1%山羊血清1∶500稀釋)，暗室內(nèi)室溫下放置60 min。(4)PBS漂洗后，即可用熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 在全骨髓細胞培養(yǎng)系(破骨細胞形成系)中，脫氧腺苷廢除了甲氨蝶呤對破骨細胞形成的抑制作用。在全骨髓細胞培養(yǎng)系中，甲氨蝶呤顯著的抑制了破骨細胞特異性抗體Kat1免疫染色陽性細胞的生成，但是這種抑制作用卻隨著脫氧腺苷的添加而逐漸地消失了，并且呈一定的劑量依賴關(guān)系。見圖1、表1。

圖1 大鼠骨髓細胞培養(yǎng)4 d后，破骨細胞特異性抗體Kat1光鏡圖像(免疫熒光×20)

表1 甲氨蝶呤和脫氧核苷對破骨細胞生成影響n=4，±s

表1 甲氨蝶呤和脫氧核苷對破骨細胞生成影響n=4，±s

注:甲氨蝶呤(1 μmol)比較，*P＜0.01

組別Kat1免疫染色陽性細胞數(shù)P值對照組49.00±2.16*0.000567甲氨蝶呤(1 μmol)2.75±1.55甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(1 μmol)0.75±0.750.382204甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(10 μmol)6.50±1.190.072334甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(100 μmol)57.50±3.18*0.001097甲氨蝶呤(1 μmol)+脫氧腺苷(200 μmol)80.00±6.54*0.000519

2.2 在佐劑引導的關(guān)節(jié)炎動物試驗模型中，甲氨蝶呤抑制了腺苷脫氨酶水平的表達。腺苷脫氨酶在罹患風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨關(guān)節(jié)切面上高度表達，而在對照組的骨標本切面上的表達比較低。腺苷脫氨酶高度表達于骨髓細胞和骨細胞外的骨破壞區(qū)域，并導致一定的彌漫性強染色模式。而經(jīng)過甲氨蝶呤注射的罹患風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠標本中，腺苷脫氨酶被明顯抑制。見圖2、3。

圖2 后踝關(guān)節(jié)的免疫熒光染色，Ti:脛骨，Ta:距骨，標尺:50 μm

圖3 關(guān)節(jié)炎大鼠距骨的骨髓位置中ADA免疫染色最強烈的部位，B:骨組織，BM:骨髓，圖標尺:50 μm

3 討論

目前從許多類風濕性病例來看，甲氨蝶呤能夠抑制骨關(guān)節(jié)滑膜表面的炎性細胞的大量增殖［6］，然而關(guān)于甲氨蝶呤如何調(diào)節(jié)炎性骨破壞所作用的分子靶點仍然還是不清楚。據(jù)報道，腺苷能夠廢除甲蝶呤對破骨細胞的形成的抑制以及對炎癥性骨破壞關(guān)節(jié)炎的治療結(jié)果［7］。而腺苷脫氨酶(ADA)是體內(nèi)調(diào)節(jié)腺苷和脫氨腺苷代謝的關(guān)鍵酶，它不僅僅降解細胞內(nèi)的腺苷而且也負責降解能夠引起淋巴細胞毒性細胞外腺苷［8］。

腺苷和脫氧腺苷在細胞外主要來源于凋亡細胞DNA的降解，在細胞內(nèi)主要來源于生理的核酸合成。這些核苷和脫氧核苷在體內(nèi)又被磷酸化而用來合成ATP或脫氧ATP并被利用合成DNA。而腺苷脫氨酶(ADA)是存在于體內(nèi)主要來降解腺苷和脫氧腺苷的關(guān)鍵酶。而據(jù)最近的文獻報道:由于基因突變導致腺苷脫氨酶的先天性缺乏，會引起嚴重的基因缺陷性疾病。抑制腺苷脫氨酶會引起細胞外腺苷和脫氧腺苷濃度的增高，尤其是脫氧腺苷濃度異常增高，從而會影響DNA的合成［9］。據(jù)臨床報道，在風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中，腺苷脫氨酶的濃度比正常人要高很多［10］。目前的數(shù)據(jù)表明:(1)在全骨髓細胞培養(yǎng)系(破骨細胞形成系)中，脫氧腺苷廢除了甲氨蝶呤對破骨細胞形成的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)關(guān)系。(2)甲氨蝶呤抑制了罹患風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)腺苷脫氨酶的水平的表達。所以我們可以推測由于甲氨蝶呤的參與，在骨關(guān)節(jié)患者的局部病灶(例如某些風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液)內(nèi)的腺苷脫氨酶有可能被抑制，從而導致了細胞外腺苷和脫氧腺苷濃度的增高，尤其是脫氧腺苷濃度異常增高。但是由于脫氧腺苷能夠有效的拮抗甲氨蝶呤對破骨細胞形成的抑制作用，所以最后造成甲氨蝶呤臨床效能大大的降低。近年來，目前對腺苷的細胞表面受體的研究很多，結(jié)合目前的數(shù)據(jù)，腺苷和脫氧核苷表面受體的拮抗劑的引入和對腺苷脫氨酶生理學方面的進一步探索有能成為未來潛在的治療手段。

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