王 佳 羅 琛

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

鯽Dmrt3基因的克隆和表達(dá)分析

王 佳 羅 琛

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

DMRT家族是一個(gè)與性別決定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族。為了研究家族成員之一的Dmrt3在我國重要養(yǎng)殖魚類鯽胚胎發(fā)育、性別分化中的功能以及在育種中的作用, 我們克隆了鯽 Dmrt3基因的 cDNA全長, 并對Dmrt3基因在發(fā)育早期和不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示: 鯽Dmrt3基因cDNA全長為2182 bp, 其中5′端非編碼區(qū)408 bp, 3′端非編碼區(qū)427 bp, 開放閱讀框1347 bp, 編碼448個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示DMRT3除了正常的DM結(jié)構(gòu)域外, 還有DMA結(jié)構(gòu)域, 在進(jìn)化上與DMRT4和DMRT5的親緣關(guān)系更近。巢式RT-PCR分析結(jié)果表明Dmrt3直到尾芽期才開始有微量表達(dá), 表達(dá)量在15體節(jié)期有明顯增加但仍然處在一個(gè)較低的水平; 在成體組織中只在精巢中檢測到表達(dá)。這種表達(dá)時(shí)空模式提示Dmrt3可能在早期器官發(fā)生和雄性性腺發(fā)育調(diào)控中起作用。對Dmrt3啟動子CpG島的甲基化分析表明所檢測的組織和配子中并不發(fā)生甲基化, 說明這種雌雄特異性和組織特異性差異表達(dá)并不是通過對該基因啟動子的差異甲基化修飾來調(diào)控的。此外, 我們還發(fā)現(xiàn)了鯽 Dmrt3的一個(gè)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的假基因 pDmrt3。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究鯽Dmrt3在性別分化中的作用和評估其在鯽性別控制育種中的價(jià)值, 以及分析 DMRT家族的進(jìn)化關(guān)系提供了基礎(chǔ)資料。

鯽; Dmrt3; 基因克隆; 基因表達(dá)

DMRT(Doublesex and Mab-3 related transcription factor)家族是一個(gè)與性別決定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族成員編碼的蛋白質(zhì)都具有一個(gè)富含半胱氨酸的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding motif, DM)[1]。該結(jié)構(gòu)域?yàn)轵蟽蓚€(gè)Zn原子的鋅指結(jié)構(gòu)[2,3],在不同的脊椎動物之間存在著高度的保守性[4]。但不同的 Dmrt家族基因在表達(dá)上存在差異并在功能上出現(xiàn)了明顯的分化。在小鼠中, Dmrt1于性別決定早期在生殖嵴中表達(dá), Dmrt1缺失的小鼠精巢分化受到嚴(yán)重的影響[5]。在已檢測過的魚類中 Dmrt1也只在性腺中表達(dá), 在其他組織中幾乎不表達(dá), 而且在雄性性腺中表達(dá)量顯著高于雌性, 表明該基因在性別決定和性腺發(fā)育中具有重要作用[6—10]。在斜帶石斑魚中的研究表明Dmrt1只在精巢的生精細(xì)胞中表達(dá)而不在支持細(xì)胞中表達(dá), 提示其可能的功能是調(diào)控精原細(xì)胞向精母細(xì)胞發(fā)育[11]。 鳉在青 胚胎發(fā)育期, Dmrt2主要在體節(jié)中胚層中表達(dá)[12]。在斑馬魚中, Dmrt2有兩個(gè)在基因加倍后形成的不同拷貝Dmrt2a和Dmrt2b[13], 二者也主要在前體節(jié)中胚層和發(fā)育中的體節(jié)中表達(dá), 但通過不同方式調(diào)節(jié)體節(jié)形成[14,15]。Dmrt3在日本河豚[16]和斑馬魚[17]性腺中的表達(dá)情況與 Dmrt1類似, 提示其可能參與了性別分化調(diào)控和雄性性腺的發(fā)育調(diào)控, 但 Dmrt3也還在器官發(fā)育階段的河豚[16]和斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)中[17], 以及在熱帶爪蟾的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)[18]。在小鼠中, Dmrt3在脊髓的DI6區(qū)神經(jīng)元中表達(dá), 參與神經(jīng)元在該區(qū)特化[19]。Dmrt4在小鼠胚胎期和出生后的發(fā)育時(shí)期都廣泛性表達(dá), 在精巢和卵巢中表達(dá)水平相當(dāng)[20], 并參與調(diào)控嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)形成[21]。在小鼠中, Dmrt5/Dmrta2主要在腦中表達(dá), 在其他組織中也有微量表達(dá), 但在卵巢中的表達(dá)水平高于在精巢中的表達(dá)水平。最近的研究表明斑馬魚 Dmrt5/Dmrta2基因除了在發(fā)育中的胚胎腦中表達(dá)外, 還在成體斑馬魚精巢中表達(dá)和調(diào)控精子發(fā)生[22]。Dmrt6只在腦中檢測到表達(dá)[23]。Dmrt7只在性腺中檢測到表達(dá), 但在卵巢中的表達(dá)量大于在精巢中的表達(dá)量, 可能在雌性生育中起重要作用[24]。

已有的研究表明, 在人類以及小鼠、斑馬魚、青 鳉等模式動物中, Dmrt1、Dmrt2和Dmrt3都具有保守的同線性關(guān)系[25], 說明這三個(gè)基因可能是通過基因擴(kuò)增后進(jìn)化而來的緊密同源基因。Dmrt3既在精巢中表達(dá)又在脊髓的神經(jīng)元中表達(dá), 與 Dmrt4、Dmrt5在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)類似, 提示其與這些基因在進(jìn)化上也有密切的關(guān)系。因此, 克隆不同脊椎動物的 Dmrt3基因, 并分析其表達(dá)時(shí)空模式, 以確定不同脊椎動物Dmrt3基因在基因序列、表達(dá)時(shí)空模式方面有無共同特征, 進(jìn)而比較其與脊椎動物其他Dmrt基因在序列上的異同, 對揭示 Dmrt基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系具有關(guān)鍵的作用, 對深入研究基因擴(kuò)增后同源基因的功能分化也具有重要意義。

鯽是我國廣泛養(yǎng)殖的重要食用和觀賞魚類, 并且具有兩性生殖的二倍體亞種和天然雌核發(fā)育的多倍體亞種, 是研究魚類生殖控制和基因組進(jìn)化的獨(dú)特材料[26,27]。因此, 克隆鯽的 Dmrt3基因, 并對其在早期發(fā)育過程中和不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析,既可為研究其進(jìn)化提供新的資料, 又可為研究Dmrt3基因在鯽這一我國重要經(jīng)濟(jì)魚類中的功能和在性別控制育種中的價(jià)值提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用鯽(Carassius auratus)為兩性生殖的二倍體鯽。雌、雄鯽均于繁殖季節(jié)購自杭州市魚類養(yǎng)殖場。雌、雄親本在本實(shí)驗(yàn)室水族箱中分別養(yǎng)殖。在繁殖季節(jié)采用人工授精的方法獲取鯽的胚胎, 置于22℃±1℃的環(huán)境發(fā)育。卵巢、精巢、心臟、肝臟、脾、腎、腦這些成體組織取自活體解剖的鯽。取得這些材料后, 迅速投入液氮冷凍, 并存于－80℃冰箱備用。

1.2 試劑

ExTaq酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體試劑盒購自Takara公司, SMARTerTMRACE試劑盒、Genome Walker試劑盒購自 ClonTech公司, CpGenome DNA修飾試劑盒購自Chemicon公司, 膠回收試劑盒購自 Axygen公司, 其余試劑均為國產(chǎn)分析純, PCR引物的合成及核苷酸序列的測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的獲得

使用總RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation System(Promega)提取鯽發(fā)育早期和成體不同組織的總RNA。將溶于無核酸酶水中的RNA置于–80℃冰箱中備用。以提取的總 RNA為模板, 使用 ClonTech公司的 SMARTer RACE試劑盒分別合成 5′和 3′RACE-Ready cDNA, 構(gòu)建cDNA文庫。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 鯽Dmrt3 cDNA的克隆

從 GeneBank中比較多種魚類和其他脊椎類的Dmrt3 cDNA的序列, 從中得到一段140 bp左右的比較保守的區(qū)域, 根據(jù)保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)簡并引物A1和A2(表1)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為10 μL, 反應(yīng)條件為: 預(yù)變性94℃, 5min, 變性94℃, 30s, 退火63.5℃, 30s, 延伸 72℃, 30s, 32個(gè)循環(huán), 然后延伸7min結(jié)束反應(yīng)。于1.2%瓊脂糖膠上電泳, 確認(rèn)目的片段之后大體系膠回收, 并克隆到pMD18-T載體上測序。測序結(jié)果經(jīng)過比對確認(rèn)其的確為Dmrt3的同源片段。然后在得到的測序結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)RGSP1和RGSP2(表1), 按照SMARTer RACE試劑盒的說明進(jìn)行5′和3′RACE擴(kuò)增。對所得到的5′端和 3′端的片段進(jìn)行拼接, 獲得鯽的 Dmrt3基因cDNA全長, 設(shè)計(jì) 5′端上游正向引物和 3′端下游反向引物DS和DAS(表1), 進(jìn)行連鎖分析確保片段的正確性。

1.5 氨基酸序列分析和多重比對

根據(jù) Dmrt3核苷酸的序列推測出其氨基酸序列。利用ClustalX軟件, 并結(jié)合NCBI的在線蛋白多序列比對工具COBALT進(jìn)行序列的比對和分析。所需的不同物種DMRT序列在GeneBank上的登錄號見表2。

1.6 半定量和嵌套式RT-PCR分析

反應(yīng)體系為20 μL, 測定所得RNA的濃度, 定量所有的RNA為1000 ng。以鯽18S rRNA為內(nèi)參。取逆轉(zhuǎn)錄cDNA各1 μL, 以引物18S rRNA-F和18S rRNA-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL: 10× ExTaq buffer 1 μL, dNTP 0.8 μL, 18S rRNA-R 0.5 μL, 18S rRNA-F 0.5 μL, ExTaq 0.1 μL, cDNA 1 μL, 水6.1 μL。預(yù)變性94℃, 5min, 接著94℃, 30s, 61℃,30s, 72℃, 30s, 28個(gè)循環(huán), 然后延伸7min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束各取5 μL產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳, UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照, 以產(chǎn)物含量最多的模板為參照, 均一化各個(gè)模板的量, 重新確定cDNA的量。確定好內(nèi)參之后, 以Dmrt3特異性引物B1和B2(表1)確定鯽Dmrt3在成體組織中的表達(dá)情況。使用嵌套引物C1和C2(表1), 其位于引物B1和B2引物的內(nèi)側(cè), 來確定基因在早期胚胎中的表達(dá)情況。

表1 克隆鯽Dmrt3 cDNA全長、表達(dá)分析和甲基化分析所用的引物Tab. 1 Primers used for cloning, expression and methylation analysis of goldfish Dmrt3

1.7 Dmrt3上游啟動子區(qū)的獲得和甲基化分析

按照Genome Walker試劑盒的要求將鯽的基因組 DNA進(jìn)行酶切消化, 每個(gè)樣品和陽性對照各取5 μL進(jìn)行電泳檢測酶切是否完全。對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接Genome Walker接頭, 得到鯽的基因組酶切文庫。根據(jù)已經(jīng)得到的Dmrt3的mRNA序列設(shè)計(jì)三條反向的引物, AP為接頭序列。最后選用GSP3AS和AP1進(jìn)行首輪PCR: 94℃預(yù)變性5min; 94℃, 25s, 72℃, 3min, 7個(gè)循環(huán); 94℃, 25s, 67℃, 3min, 32個(gè)循環(huán); 67℃, 最后延伸7min, 所得到的PCR產(chǎn)物稀釋20倍, 然后以GSP1AS和AP2進(jìn)行二輪的巢式PCR: 94℃預(yù)變性5min; 94℃, 25s, 72℃, 3min, 5個(gè)循環(huán); 94℃, 25s, 67℃, 3min, 20個(gè)循環(huán); 67℃, 延伸7min, 擴(kuò)增得到Dmrt3的上游啟動子序列。

利用網(wǎng)上公開的CpG島預(yù)測和甲基化PCR引物設(shè)計(jì)軟件 MethPrimer, 通過該軟件對啟動子區(qū)CpG 島設(shè)計(jì)亞硫酸氫鹽 PCR引物 Meth-S和Meth-AS(表1)。根據(jù)常規(guī)的苯酚氯仿有機(jī)溶劑抽提DNA的方法提取鯽DNA, 并根據(jù)CpGenome DNA修飾試劑盒說明書對基因組 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾處理, 之后進(jìn)行甲基化特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 鯽Dmrt3 cDNA的克隆

用 SMARTer RACE試劑盒進(jìn)行 3′RACE和5'RACE獲得了鯽Dmrt3的cDNA的完整序列。該序列全長為 2182 bp, 其中 5′端非編碼區(qū)(5′-UTR) 408 bp, 3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)427 bp, 開放閱讀框(ORF)1347 bp, 編碼 448個(gè)氨基酸。序列已提交至GenBank(登錄號: KC733765)。

表2 本文所引用的不同物種Dmrt在GeneBank中的登錄號Tab. 2 Cited GeneBank accession numbers of various Dmrts

此外, 我們在進(jìn)行 Dmrt3基因組分析時(shí)還在鯽基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)只有部分編碼序列的Dmrt3基因拷貝。該拷貝全長625 bp, 包含起始密碼ATG和polyA加尾信號序列, 在編碼區(qū)域有多個(gè)終止的密碼。這些特征說明其是一個(gè)從mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而來,并已缺失了大部分編碼序列的加工假基因。該假基因已經(jīng)命名為pDmrt3并也已提交至GenBank(登錄號: KC733764)。

2.2 鯽 DMRT3蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測及進(jìn)化分析 Dmrt基因家族進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用Jellyfish軟件, 利用所獲得的Dmrt3核苷酸序列推測出Dmrt3的氨基酸序列如圖1a所示。氨基酸序列同源性分析表明, 鯽 Dmrt3編碼的氨基酸序列和斑馬魚(Danio rerio)的序列同源性為 90.8%,和爪蟾(Xenopus laevis)序列同源性為 64.9%, 和小鼠(Mus musculus)序列同源性為62.3%。利用SMART在線分子結(jié)構(gòu)預(yù)測工具(http://smart.embl.de/)對鯽DMRT3的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了DM結(jié)構(gòu)域外, 還有DMA結(jié)構(gòu)域(圖1b)。

圖1 推測的鯽DMRT3氨基酸序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 The putative amino acid sequence and the diagram of the putative conserved domains of goldfish DMRT3

對GenBank數(shù)據(jù)庫上能搜索到的不同脊椎動物Dmrt家族成員氨基酸序列及得到的鯽Dmrt3推測出來的氨基酸序列進(jìn)行比對, 將比對的結(jié)果導(dǎo)入NCBI, 采用Neighbor Joining方法并利用COBALT工具輔助構(gòu)了 Dmrt基因家族建進(jìn)化樹(圖 2)。因DMRT6只有小鼠一個(gè)物種的序列信息, 并且其DMRT8序列(ABC48237.1)與Dmrt家族的其他序列存在大于 85%的差異, 在建立進(jìn)化樹時(shí)將它們排除。從構(gòu)建的進(jìn)化樹中可以看到鯽的 DMRT3與斑馬魚DMRT3最為接近, 紅鰭東方 鲀和黃鱔聚為同一亞族, 再和斑馬魚-鯽這一支聚為一個(gè)大支, 爪蟾和小鼠聚為一支, 再和上述大支聚合, 這與其分類地位是一致的。還可以看出DMRT3、DMRT4、DMRT5在進(jìn)化上是很接近的, 分為一個(gè)大支, DMRT2和DMRT7在進(jìn)化上親緣關(guān)系比較近, DMRT1形成單獨(dú)的一支。

2.3 鯽 Dmrt3在早期各個(gè)發(fā)育時(shí)期和各個(gè)組織中的表達(dá)情況

半定量 RT-PCR分析表明在鯽早期胚胎發(fā)育過程中, Dmrt3在尾芽期以前檢測不到表達(dá), 在尾芽期經(jīng)嵌套式PCR才檢測到微量表達(dá), 到 15體節(jié)期其表達(dá)量明顯增加但仍然難以經(jīng)一輪 RT-PCR檢測到(圖3)。在鯽成體組織中, 半定量RT-PCR只在精巢中檢測到 Dmrt3表達(dá), 在卵巢、心臟、肝臟、脾、腎和腦等組織中都未檢測出表達(dá)(圖 4)。其中, +RT表示cDNA合成時(shí)加入了逆轉(zhuǎn)錄酶, -RT表示cDNA合成時(shí)沒有加入逆轉(zhuǎn)錄酶。

2.4 鯽Dmrt3啟動區(qū)的甲基化分析

鯽Dmrt3只在成體精巢中被檢測到表達(dá), 在卵巢和其他成體組織中都沒有檢測到表達(dá)。為了解這種兩性特異性和組織特異性差異表達(dá)是否與差異甲基化有關(guān), 我們用在線工具 MethPrimer對鯽的Dmrt3啟動區(qū)1207 bp進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明在該基因起始密碼子上游啟動子的–215至–71 bp區(qū)域內(nèi)的GC含量大于50%, 符合CpG島的標(biāo)準(zhǔn)。為此, 我們對該 CpG島在鯽的不同組織和配子中的甲基化狀況進(jìn)行了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換測序分析。結(jié)果表明在所有被檢測的鯽組織和配子中, 除極少數(shù)克隆中的部分位點(diǎn)發(fā)生不穩(wěn)定的甲基化外, 總體上Dmrt3啟動子區(qū)的CpG島不發(fā)生甲基化(圖5)。這一結(jié)果說明 Dmrt3的性別特異性和組織特異性表達(dá)并不是通過對該基因啟動子 CpG島的差異甲基化修飾來調(diào)控的。

3 討論

3.1 DMRT3與其他DMRT家族成員的進(jìn)化關(guān)系

氨基酸序列的保守性分析表明鯽DMRT3與其他脊椎動物的DMRT3一樣, 除了具有DMRT家族蛋白所都具有的DM結(jié)構(gòu)域外, 還有DMA結(jié)構(gòu)域。根據(jù)序列保守性所進(jìn)行的不同脊椎動物DMRT3的進(jìn)化分析表明鯽的DMRT3與斑馬魚DMRT3最為接近,紅鰭東方 鲀和黃鱔聚為同一亞族,再和斑馬魚-鯽這一支聚為一個(gè)大支, 爪蟾和小鼠聚為一支, 再和上述大支聚合。這與用傳統(tǒng)方法所進(jìn)行的物種親緣關(guān)系分類結(jié)果一致。

圖2 采用Neighbor Joining方法構(gòu)建的不同物種DMRT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of DMRT family generated with Neighbor Joining method

圖3 鯽胚胎發(fā)育早期Dmrt3的表達(dá)Fig. 3 Dmrt3 expression during early embryogenesis in goldfish

圖4 鯽成體組織中Dmrt3的表達(dá)RT-PCR檢測Fig. 4 RT-PCR examination of Dmrt3 expression in various adult tissues of goldfish

在Dmrt基因家族中, Dmrt1、Dmrt2、Dmrt3位于同一個(gè)連鎖群上,提示我們這三個(gè)基因很可能是通過基因擴(kuò)增進(jìn)化而來的緊密同源的基因。但DMRT1、DMRT2中只有DM結(jié)構(gòu)域, 而DMRT3與DMRT4、DMRT5一樣既有DM又有DMA結(jié)構(gòu)域, 而且都在神經(jīng)系統(tǒng)中檢測到了表達(dá)[17,20,23], 提示其與DMRT4、DMRT5在進(jìn)化上可能存在更為直接的關(guān)系。進(jìn)化樹表明 DMRT3、DMRT4與DMRT5在進(jìn)化上的親緣關(guān)系的確更近(圖2)。由于DMA結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是更古老的結(jié)構(gòu)域[28],因此DMRT3可能是比DMRT1和DMRT2更原始的基因。在脊椎動物基因擴(kuò)增和整個(gè)基因組加倍后冗余基因的進(jìn)化過程中, 一般只有原始的多功能基因通過冗余基因拷貝以互補(bǔ)的方式分享其原始基因的功能而產(chǎn)生新的基因[29,30]。因而Dmrt3可能是Dmrt基因家族中原始的多功能基因。Dmrt1和Dmrt2、Dmrt3的連鎖關(guān)系提示Dmrt1和Dmrt2可能是Dmrt3基因擴(kuò)增后功能分化產(chǎn)生的新基因。位于不同染色體上的 Dmrt3、Dmrt4和 Dmrt5基因所編碼的蛋白都具有 DM 和DMA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域, 提示這些基因是經(jīng)歷基因組加倍后分化而產(chǎn)生的新基因。

圖5 Dmrt3啟動子CpG島在胚胎和不同成體組織中的甲基化狀態(tài)Fig. 5 Methylation state of Dmrt3 promoter CpG island in embryo and various adult tissues

3.2 鯽Dmrt3的表達(dá)與在發(fā)育過程中的可能功能

鯽Dmrt3在早期胚胎發(fā)育階段沒有檢測到表達(dá),尾芽期開始檢測到微量表達(dá), 在此之后其表達(dá)水平逐步提高, 到 15體節(jié)期可以檢測到較高水平的表達(dá)。這種表達(dá)時(shí)間模式與斑馬魚中類似, 但在鯽中該基因在胚胎發(fā)育階段的表達(dá)水平顯然比在同期斑馬魚胚胎中要低, 即使到15體節(jié)期也需要用嵌套式PCR才能檢測到。因此, 我們沒有做進(jìn)一步的組織特異性表達(dá)原位雜交分析。由于已有的研究表明在DMRT家族中, 具有DMA結(jié)構(gòu)域的DMRT3、DMRT4、DMRT5能在神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)器官中表達(dá)[16,17], 提示鯽的 DMRT3也可能在器官發(fā)生階段在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控中起作用。

在鯽成體組織中, 所檢測7種組織中Dmrt3只在精巢中表達(dá)(圖4)。這與日本河豚魚Dmrt3在精巢中表達(dá)[16]相同, 但與斑馬魚Dmrt3在精巢和卵巢中都有表達(dá)[17]存在差異。這些觀察結(jié)果提示Dmrt3的功能在鯽和日本河豚中可能比在斑馬魚中有了進(jìn)一步的限定, 在成體階段只保留了調(diào)控雄性性腺發(fā)育的功能。因此, 在深入了解鯽 Dmrt3基因在雄性性腺發(fā)育調(diào)控中的功能和機(jī)制后, 可用于鯽雄性控制育種。

對Dmrt3啟動子CpG島的甲基化分析表明所檢測的組織和配子中并不發(fā)生甲基化, 說明鯽中Dmrt3雌雄特異性和組織特異性差異表達(dá)并不是通過對該基因啟動子的差異甲基化修飾來調(diào)控的。由于Dmrt1、Dmrt2、Dmrt3位于同一個(gè)連鎖群上, 這些基因的表達(dá)是否有共同的調(diào)控元件和調(diào)控機(jī)制還不清楚, 因此, 不能排除其他 Dmrt基因如果發(fā)生差異甲基化對Dmrt3雌雄特異性差異表達(dá)的可能影響。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF DMRT3 IN GOLDFISH, CARASSIUS AURATUS

WANG Jia and LUO Chen
(Collage of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The DMRT family of transcription factors play a pivotal role in sex determination. In order to investigate the function of Dmrt3, a member of the DMRT family, in the embryogenesis and sex differentiation, as well as its potential implication in breeding of goldfish, we cloned the full length cDNA of Dmrt3 and analyzed its expression during the early embryogenesis and in various adult tissues in goldfish, Carassius auratus. The entire goldfish Dmrt3 cDNA is 2182 bp long, including a 408 bp 5′-UTR, a 427 bp 3′-UTR and a 1347 bp open reading frame (ORF); the latter encoded a protein with 448 amino acids. Protein structural prediction based on the putative amino acid sequence of DMRT3 revealed that goldfish DMRT3 contained a common DM domain and a DMA domain, suggesting that it was more phylogenetically related to DMRT4 and DMRT5. Nested PCR examination indicated that the expression of Dmrt3 was undetectable until bud stage, and its expression obviously increased but still at a low level at 15-somite stage. In adult tissues, DMRT3 was expressed exclusively in the testes. This expression pattern suggested that Dmrt3 might regulate organogenesis and gonad development of male. No methylation of the Dmrt3 promoter CpG-island in gametes and in various tissues was observed using bisulfite sequencing analysis, suggesting that DNA methylation did not regulate the sex-specific and tissue-specific expression of Dmrt3. Moreover, we identified a pseudogene, named pDmrt3, from the reverse transcript of Dmrt3. These results provide essential materials for studying the function of Dmrt3 in the sex differentiation and potential application in breeding of goldfish, as well as the evolutionary relationship of Dmrt genes.

Goldfish; Dmrt3; Gene cloning; Gene expression

Q781

A

1000-3207(2014)03-0548-08

10.7541/2014.77

2013-05-09;

2013-12-20

國家973項(xiàng)目(編號: 2010CB126301); 浙江省科技重大專項(xiàng)(2012C12907-9)資助

王佳(1989—), 男, 陜西渭南人; 碩士; 主要從事發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: wangjia1019@163.com

羅琛; E-mail: luoc@zju.edu.cn