劉鹿憶謝 平

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430074; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

微囊藻毒素-LR對小鼠腸道消化酶的影響

劉鹿憶1謝 平2

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430074; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

微囊藻毒素-LR(MCLR)是一類對動物和人類健康影響很大的藍藻毒素。已有調(diào)查認(rèn)為MCLR能導(dǎo)致某些胃腸道疾病, 相關(guān)實驗室資料也證實 MCLR能在腸道積累并引起腸道損傷。研究對小鼠連續(xù)腹腔染毒MCLR 28d, 觀察腸道病理水平及超微結(jié)構(gòu)的變化, 并測定腸黏膜刷狀緣膜酶活性。結(jié)果顯示, 小腸絨毛受損較嚴(yán)重, 絨毛數(shù)量減少、部分脫落至腸腔, 固有層及黏膜下層水腫、充血; 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)腸細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)電子密度降低, 伴有線粒體腫脹、細(xì)胞核變形現(xiàn)象; 腸黏膜二糖酶(蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶)、堿性磷酸酶及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性均呈下降趨勢。在亞慢性MCLR染毒條件下, 腸道的消化功能可能受到抑制, 進而導(dǎo)致機體對營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良。研究對理解藍藻毒素引起的胃腸道不適(如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉)提供了新的證據(jù)。

微囊藻毒素; 腸道; 酶活; 超微結(jié)構(gòu)

微囊藻毒素(Microcystins, 簡稱 MC)是一類具有生物活性的單環(huán)七肽[1], 具有強烈的肝毒性[2,3]。迄今為止, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了90多種MC的同系物[4], 其中MCLR、MCRR和MCYR是最常見、分布最多的種類, L、R和Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。MCLR因其急性毒性最強受到廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為MCLR最重要的致毒機制是其蛋白磷酸酶抑制作用。MCLR抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1和2A,破壞蛋白磷酸化/去磷酸化動態(tài)平衡[5], 導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度磷酸化, 干擾多種細(xì)胞進程并影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[6,7]。此外, 氧化應(yīng)激被認(rèn)為是MCLR毒性作用的另一個重要機制, 由此產(chǎn)生的損傷包括造成機體活性氧增加, 改變細(xì)胞抗氧化酶活性, 破壞氧化還原系統(tǒng)平衡, 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷[8,9]。

近年來, 因誤食銅綠微囊藻或攝入MCLR引起胃腸道功能紊亂的事件時有發(fā)生[10]。Ito, et al.[11]發(fā)現(xiàn), 口服給藥MCLR主要通過小腸吸收, 絨毛上皮及固有層顯示強烈的MCLR陽性染色, 絨毛頂端嚴(yán)重侵蝕。許多關(guān)于魚類經(jīng)口染毒MC的報道均表明此類毒素具有腸毒性[12—14], 表現(xiàn)為腸細(xì)胞空泡化、腸黏膜損傷及炎性癥狀等。對小鼠采用氣管內(nèi)染毒[15]或利用腸細(xì)胞系[16]進行體外毒性試驗, 也證實 MC能在腸道積累或?qū)δc細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。無論利用何種試驗?zāi)Ｐ?動物或細(xì)胞)采用何種染毒方式(經(jīng)口或吸入), MCLR都能在腸道積累并對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損傷, 因而腸道正常功能可能也受其影響。腸道損傷可能導(dǎo)致腸黏膜對營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收受阻,或造成腸黏膜細(xì)菌移位和炎性反應(yīng)。這些可能是微囊藻毒素污染的水源或水產(chǎn)品引起腹痛、腹瀉及胃腸炎相關(guān)疾病的原因之一。

小腸是食物消化吸收最主要的部位, 腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞刷狀緣的消化酶在最終消化階段處于關(guān)鍵地位, 其活性與腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān), 是監(jiān)測小腸功能受損最敏感的指標(biāo)。本研究選擇與糖類和蛋白質(zhì)消化相關(guān)的二糖酶及堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶作為腸黏膜刷狀緣消化酶的代表。二糖酶將食物或淀粉消化物中的雙糖水解為相應(yīng)的單糖(葡萄糖、半乳糖和果糖), 以供機體吸收和利用。哺乳動物中蔗糖酶、麥芽糖酶和乳糖酶最重要, 因而在本研究中選擇檢測這三種二糖酶的活性。堿性磷酸酶與脂肪、糖類和蛋白質(zhì)的吸收與運輸密切相關(guān)[17,18],同時也是生物體內(nèi)重要的解毒及防御系統(tǒng)[19,20]。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶參與 γ-谷氨?；h(huán)及谷胱甘肽代謝,與氨基酸吸收和二肽轉(zhuǎn)運有關(guān), 該酶的活性影響機體攝取氨基酸的數(shù)量。

已有報道指出, MC染毒能引起胃腸道功能紊亂或不適, 但并未涉及相關(guān)病因[10]。結(jié)合 MC對腸黏膜顯微及超微結(jié)構(gòu)損傷的研究, 作者推測 MC損傷腸道正常結(jié)構(gòu)的同時可能同樣影響腸道的正常功能。我們選擇MCLR腹腔注射Balb/c小鼠28d, 以空腸為代表, 觀察腸道顯微及超微結(jié)構(gòu)變化, 測定黏膜消化酶活性, 以期為MCLR致腸道疾病提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MCLR為本實驗室純化, 純度經(jīng)HPLC檢測>95%。清潔級Balb/c小鼠6—8周, 體重約為20 g/只, 由武漢大學(xué)動物實驗中心提供。RM2145半自動切片機為德國 Leica公司產(chǎn)品。BX-50光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。Tecnai G2 20透射電子顯微鏡為FEI公司產(chǎn)品。全波長酶標(biāo)儀為 Thermo Scientific公司產(chǎn)品。二糖酶、堿性磷酸酶和 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 劑量設(shè)置和動物處理

MCLR濃度分別為 5和 20 μg/kg, 注射量為0.2 mL/只, 對照組注射等體積生理鹽水。每組平行處理6只小鼠, 連續(xù)28d腹腔注射。

1.3 取樣

按照上述劑量注射小鼠, 于 29d頸椎脫臼法處死。迅速分離小腸, 選取空腸部位, 分別切取 1 cm腸段放入波恩氏液和2.5%戊二醛溶液固定。同時取10 cm左右腸段, 沿腸系膜縱向剖開, 用4℃生理鹽水將內(nèi)含物洗盡, 濾紙吸干水分, 再用蓋玻片輕輕刮取腸黏膜, 分裝在1.5 mL離心管中, 立即放入液氮速凍, 隨后轉(zhuǎn)入–80℃超低溫冰箱凍存。

1.4 光鏡樣品制備及觀察

小腸組織常規(guī)梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 連續(xù)切片, 厚度為4 μm, HE染色, 脫水封片。光學(xué)顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.5 電鏡樣品制備及觀察

取小腸組織修切至 1 mm3, 1%鋨酸固定, 梯度乙醇脫水, Epon812環(huán)氧樹脂浸透、包埋, LKB-V超薄切片機切片, 經(jīng)飽和醋酸鉛雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色, 最后在透射電鏡下進行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察與拍照。

1.6 空腸黏膜消化酶活性測定

腸黏膜刮取物按 1∶10(w/v)在冰冷的生理鹽水中勻漿, 4℃, 5000 g/min離心15min, 取上清進行酶活測定。二糖酶(蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶)、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性分別按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測定。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA), LSD多重比較, P<0.05認(rèn)為有顯著性差異, P<0.01認(rèn)為具有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重

在 4周試驗過程中各組小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對照組及低劑量組小鼠體重穩(wěn)定增長, 飲食飲水量及活動性無明顯差異; 高劑量小鼠體重呈持續(xù)下降趨勢, 在第2周至第3周出現(xiàn)飲食量驟增, 明顯高于其他兩組, 且小鼠表現(xiàn)亢奮狀態(tài), 之后飲食量有所下降, 但仍高于對照及低劑量組(Fan, et al. 未發(fā)表數(shù)據(jù))。

2.2 病理學(xué)變化

大體病理學(xué) 對照組及低劑量組小鼠各器官表現(xiàn)正常, 高劑量小鼠器官普遍出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象, 明顯小于前兩組。小腸變細(xì), 個別腸道外觀發(fā)黑, 疑似腸內(nèi)出血(圖1)。

圖1 對照組及高劑量組小鼠空腸黏膜照片(a示對照組, b示20 μg/kg bw MC-LR組)Fig. 1 Pictures of jejunal mucosa in control and high dosage group mice (a. control; b. 20 μg/kg bw MC-LR)

光鏡觀察 對照組空腸結(jié)構(gòu)完好, 小腸絨毛連貫完整、排列整齊, 絨毛表面覆蓋柱狀細(xì)胞, 數(shù)量眾多, 與杯細(xì)胞相間排列, 各細(xì)胞大小均勻一致(圖2a); 黏膜固有層結(jié)構(gòu)完整, 無炎性癥狀(圖2b)。低劑量組空腸結(jié)構(gòu)與對照組無差異(圖2c、圖2d)。高劑量組空腸結(jié)構(gòu)變化較明顯, 與對照組及低劑量組相比, 絨毛稀少(圖2e); 固有層及黏膜下層水腫、充血, 胞質(zhì)普遍嗜酸性(圖2f)。

超微結(jié)構(gòu)變化 在透射電鏡下, 對照組空腸上皮細(xì)胞微絨毛豐富, 細(xì)胞連接正常(圖3a), 細(xì)胞核形態(tài)完整, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體(圖3b)。與光鏡結(jié)果類似, 低劑量組與對照組相比無明顯變化(圖3c、圖3d)。高劑量組腸上皮細(xì)胞受損嚴(yán)重, 細(xì)胞質(zhì)電子密度降低, 出現(xiàn)空泡化區(qū)域, 線粒體腫脹、基質(zhì)丟失(圖3e); 細(xì)胞核變形、核膜破裂(圖3f)。

2.3 空腸消化酶活性

空腸黏膜二糖酶活性、堿性磷酸酶活性和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性見表1。

圖2 不同劑量MC-LR腹腔注射染毒28d小鼠空腸HE染色切片F(xiàn)ig. 2 H&E stained sections of jejuna from mice injected i.p. with different dose of MC-LR after 28d

表1 MC-LR對小鼠空腸黏膜消化酶活性的影響Tab. 1 Effects of MC-LR on jejunal mucosal digestive enzyme activity of male Balb/c mice after 28 d intraperitoneal injection

與對照組相比, 低劑量組二糖酶活性均無明顯變化; 相反, 高劑量組蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶活性分別下降15.40%、25.73%和22.88%(P<0.01)(圖4)。

圖3 不同劑量MC-LR腹腔注射染毒28d小鼠空腸超微結(jié)構(gòu)(a, b. 0 μg/kg bw; c, d. 5 μg/kg bw; e, f. 20 μg/kg bw 放大倍數(shù): 2500×)Fig. 3 Ultrastructure of jejuna from mice injected i.p. with different dose of MC-LR after 28d (a, b. 0 μg/kg bw; c, d. 5 μg/kg bw; e, f. 20 μg/kg bw magnification: 2500×)

a, c. 對照組及低劑量組線粒體豐富且完好, 細(xì)胞緊密連接; b, d. 細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整, 周圍有大量線粒體; e. 高劑量組細(xì)胞質(zhì)電子密度降低, 明顯的空泡化及線粒體腫脹; f. 核膜破裂、核變形, 周圍的細(xì)胞質(zhì)空泡化、線粒體腫脹

a, c. abundant and intact mitochondria in control and low dose group mice; b, d. nuclei in good appearance with plentiful mitochondria around; e. decreased density of cytoplasm in high dose group mice, obvious vacuolization and swollen mitochondria; f. rupture of nuclear membrane and deformation of nuclear with vacuolated cytoplasm and swollen mitochondria around

圖4 MC-LR對小鼠空腸黏膜二糖酶活性的影響Fig. 4 Effect of MC-LR on jejunal mucosal disaccharidases activities of mice after 28 d i.p.

與對照組相比, ALP活性在低劑量組升高5.75%(P<0.05), 高劑量組則降低24.24%(P<0.01)(圖5)。γ-GT活性在對照組和低劑量組中無明顯差異;高劑量組活性降低26.91%(P<0.01)(圖5)。

3 討論

目前, 水體富營養(yǎng)化已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的水環(huán)境問題。水華不僅影響水體環(huán)境, 而且使水質(zhì)嚴(yán)重惡化, 對家畜和人類健康造成威脅[21—25]。藍藻毒素能引起一系列胃腸道疾病, 包括腹瀉、嘔吐、惡心和腸胃炎[10,26]。已有報道證實 MC對魚類[12—14,27]及嚙齒類[11,15,28,29]均有腸毒性, 本研究利用MCLR連續(xù)腹腔注射Balb/c小鼠28d, 觀察腸道結(jié)構(gòu)和功能的變化, 以期為藍藻毒素致腸道損傷提供新的證據(jù)。

本研究中, 組織病理學(xué)檢測結(jié)果和超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果均證實MCLR暴露會引起腸道病理損傷。在本實驗中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的腸道退行性變化, 高劑量組小腸絨毛數(shù)量銳減, 剝落至腸腔; 固有層及黏膜下層水腫、充血。電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)電子密度降低,空泡化嚴(yán)重, 線粒體腫脹、基質(zhì)丟失, 核膜破裂、核變形。連續(xù)28d腹腔注射MCLR, 毒素通過腸肝循環(huán)和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽進入小腸, 并在固有層內(nèi)積累, 導(dǎo)致腸道不可逆損傷。

圖5 MC-LR對小鼠空腸黏膜堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig. 5 Effects of MC-LR on jejunal mucosal ALP and γ-GT activities of mice after 28 d i.p.

二糖酶的活性依賴絨毛結(jié)構(gòu)的完整性。酶活性結(jié)果顯示, 低劑量組與生理鹽水組相比無變化, 高劑量組酶活顯著降低, 表明MCLR使腸黏膜結(jié)構(gòu)受損, 同時降低關(guān)鍵酶活性, 影響糖類物質(zhì)的消化。二糖酶活性受到抑制, 腸道對單糖的吸收、轉(zhuǎn)化和利用降低, 可能導(dǎo)致血糖下降。Fan, et al. 檢測本次實驗中小鼠的血糖, 得出“高劑量組血糖含量顯著低于對照組和低劑量組”(Fan, et al. 未發(fā)表數(shù)據(jù)), 證實了這個推測。在亞慢性染毒試驗過程中, 多次反復(fù)注射使得毒素在各器官內(nèi)大量積累, 以致超過機體所能承受的范圍, 大量細(xì)胞凋亡、壞死, 造成器官普遍萎縮和退行性變化。小腸作為受影響器官之一,其黏膜二糖酶活性明顯降低, 大量寡糖無法水解為可吸收的葡萄糖、果糖和半乳糖形式, 機體對單糖的吸收受到抑制, 使得細(xì)胞可利用糖源減少、機體供能不足, 動物表現(xiàn)消瘦。

除了二糖酶, 小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣上還存在堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶[30]。本研究表明亞慢性MCLR染毒, 堿性磷酸酶活性在低劑量組中顯著升高, 在高劑量組中極顯著降低。由于受到低劑量毒素刺激, 機體可能產(chǎn)生了某種機制以適應(yīng)染毒狀態(tài)下對酶活性增加的需求, 加快相應(yīng)酶促反應(yīng)及生理生化進程, 降低毒素毒性或促進毒素排出。此外, 堿性磷酸酶活性的升高可能是酶蛋白本身在mRNA表達水平升高或酶蛋白的合成增加, 亦或是兩方面因素的共同作用造成的, 這在回腸/結(jié)腸炎大鼠模型[31]及體外腸細(xì)胞系[32]已被證實。低劑量毒素一方面刺激機體已有的堿性磷酸酶活性升高, 另一方面可能促進腸黏膜表達更多的堿性磷酸酶, 兩者結(jié)合以促進機體對毒素的降解或排除。而在高劑量組中, 腸黏膜結(jié)構(gòu)受損程度超過機體所能承受范圍,機體無法采取足夠的應(yīng)對措施以保證其正?；钚?堿性磷酸酶受到抑制活性顯著下降, 這種情況常常出現(xiàn)在較嚴(yán)重的病理狀態(tài)下[33,34]。在我們的試驗中,堿性磷酸酶活性的變化類似于毒物興奮效應(yīng), 即高劑量致毒因素對生物體有害, 而低劑量致毒因素對生物體有益[35]。當(dāng)暴露于低劑量MCLR時, 誘導(dǎo)機體適應(yīng)性反應(yīng)以產(chǎn)生一系列生理補償效應(yīng), 例如增加堿性磷酸酶活性加快解毒途徑; 而高劑量毒素處理對機體造成嚴(yán)重?fù)p傷, 機體無法有效清除毒性效應(yīng), 防御系統(tǒng)受到抑制。

在本研究中, 檢測MCLR染毒后γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性是否發(fā)生變化, 可間接考察機體對蛋白質(zhì)和氨基酸的吸收是否受到影響。結(jié)果表明, 連續(xù)腹腔注射MCLR 28d, 低劑量組γ-GT活性與對照組相比無明顯變化, 而高劑量組此酶活性顯著降低。高劑量組小鼠腸道 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶受到抑制, 與之相關(guān)的谷胱甘肽代謝及氨基酸吸收均可能受到影響。谷胱甘肽是機體重要的抗氧化物質(zhì), 在MCLR染毒產(chǎn)生過量活性氧的解毒過程中發(fā)揮重要作用。高劑量小鼠腸黏膜 γ-GT活性降低, 谷胱甘肽合成受到影響,擴大了MCLR染毒對腸黏膜造成的氧化損傷。另一方面, γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性降低可能導(dǎo)致腸道對氨基酸的吸收受阻, 機體無法獲得足夠的蛋白質(zhì)。在最近的一項研究中, He, et al.[36]發(fā)現(xiàn)MCLR能顯著抑制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 尤其是氨基酸和脂類物質(zhì)的吸收。MCLR通過抑制 γ-GT活性導(dǎo)致某些氨基酸吸收受阻, 造成腹瀉或營養(yǎng)不良。

4 結(jié)語

通過對 Balb/c小鼠連續(xù)腹腔注射染毒 MCLR 28d發(fā)現(xiàn), 腸黏膜消化酶活性受到明顯抑制, 顯微鏡檢及超微結(jié)構(gòu)均表明腸道出現(xiàn)損傷, 說明 MCLR對腸道產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)。MCLR破壞腸道的正常結(jié)構(gòu)和功能可能導(dǎo)致機體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率降低, 造成高劑量組動物體重明顯下降、普遍消瘦。日常生活中MC污染主要通過飲水、消費相關(guān)水產(chǎn)品或食用藍藻保健品進入人體, 這種途徑下小腸是吸收MC的主要器官, MC暴露必然影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的攝入或干擾腸黏膜免疫系統(tǒng), 其對腸道的毒性效應(yīng)值得進一步研究。

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EFFECTS OF MICROCYSTIN-LR ON THE DIGESTIVE ENZYME ACTIVITY OF INTESTINAL TRACT IN BALC/C MICE

LIU Lu-Yi1and XIE Ping2
(1. College of Fishery, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430074, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Microcystin-LR has been known to harm the health in both humans and animals. Recently there has been an increase in reports about gastrointestinal ailments resulting from the ingestion of MCLR. Some data also indicated that MCLR could accumulate in the intestinal tract and cause injuries. In this study, we intraperitoneally injected mice with MCLR for 28 days, and observed the pathophysiological and ultrastructural changes. We also examined the activities of intestinal mucosal brush border membrane enzymes. Severe injuries were found in villi, such as a decrease in villi number and the exfoliation of villi into gut cavity. The cells of lamina propria and submucosa showed swell and hyperemia. In the ultrathin sections, loss of density in the cytoplasm associated with swollen mitochondria as well as nuclei deformation was observed. The activities of intestinal disaccharidase (sucrase, maltase, lactase), alkaline phosphatase, and γ-glutamyl transferase decreased after the MCLR exposure. Based on these results, we reasoned that the digestion capacity of small intestine might be inhibited after subchronic exposure of MCLR, which led to malabsorption. Our study suggested new cellular mechanisms that explain gastrointestinal sickness, such as nausea, vomiting and diarrhea, induced by cyanobacterial toxins.

Microcystin; Intestinal tract; Enzyme activity; Ultrastructure

X503.22

A

1000-3207(2014)03-0533-07

10.7541/2014.75

2013-04-16;

2014-01-12

中國國家自然科學(xué)基金(31070457)資助

劉鹿憶(1987—), 女, 江西贛州人; 碩士研究生; 主要從事微囊藻毒素分子毒理學(xué)研究。E-mail: sjtzcqn@aliyun.com

謝平, E-mail: xieping@ihb.ac.cn