張德鋒李愛華龔小寧

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

鱘分枝桿菌病及其病原研究

張德鋒1,2李愛華1龔小寧1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

2009—2010年間, 我國人工養(yǎng)殖的中華鱘(Acipenser sinensis)、史氏鱘(Acipenser schrencki)和雜交鱘(hybrid sturgeon: A. baeri-A. gueldenstaedtii)暴發(fā)了細菌性疾病?；疾△\通過組織切片觀察, 病原菌的分離、鑒定以及組織樣品中病原菌的?檢測, 結果顯示從19條患病鱘中分離到49株分枝桿菌。病原菌經(jīng)過多個保守基因的測序分析和部分生理生化特征的鑒定, 共發(fā)現(xiàn)有 7種分枝桿菌, 分別為龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonae)、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、戈登氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、蘇爾加分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、豬分枝桿菌 (Mycobacterium porcinum)和Mycobacterium arpuense。在診斷過程中發(fā)現(xiàn)兩種或三種分枝桿菌同時存在于同一樣品中, 分子生物學的診斷結果表明分枝桿菌復合感染十分常見, 而海分枝桿菌是分枝桿菌復合感染中最為常見的分枝桿菌。分離的病原菌對斑馬魚的攻毒試驗結果表明在以上 7種分枝桿菌中海分枝桿菌的毒力最強。以上結果表明海分枝桿菌是鱘分枝桿菌病的主要致病菌, 分枝桿菌復合感染是鱘分枝桿菌病的主要感染形式。研究中史氏鱘和中華鱘的分枝桿菌病, 以及在病魚體內(nèi)分離的豬分枝桿菌和M. arupense在國內(nèi)外均尚未見報道。

鱘; 分枝桿菌; 鑒定; 系統(tǒng)發(fā)育分析; 復合感染

分枝桿菌病是魚類常見的細菌性疾病之一, 目前已經(jīng)在 150多種魚類中發(fā)現(xiàn)了分枝桿菌病[1], 它是由非結核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria, NTM) 造成的長期性感染疾病, 尤其當魚類個體的免疫系統(tǒng)處于較弱的時候更易感染[2]。非結核分枝桿菌廣泛存在于水體、土壤、空氣等自然環(huán)境中[3,4],它也是人的一種機會致病菌, 對人類尤其是漁民的健康構成威脅。非結核分枝桿菌可以分為速生型分枝桿菌(Rapidly growing mycobactreia, RGM)和緩慢生長型分枝桿菌(Slowly growing mycobacteria, SGM), 前者的培養(yǎng)時間一般少于 7d, 而后者的培養(yǎng)時間通常大于7d, 需要培養(yǎng)2—4周才形成清晰可見的菌落。在魚類分枝桿菌中, 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)和海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)是魚類常見的病原菌[5]。而且, 戈登分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)和蘇爾加分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)等也常在病魚中分離到[6—8]。然而, 鱘分枝桿菌病卻很少有報道, 更沒有關于鱘分枝桿菌病暴發(fā)和流行的相關報道。目前, Pate, et al.[9]在斯洛文尼亞對觀賞魚病原菌調(diào)查時發(fā)現(xiàn)小體鱘(Acipenser ruthenus)可以感染偶發(fā)分枝桿菌。Stragier, et al.[10]在比利時的雜交鱘(Acipenser baerii-Acipenser guldenstaedtii hybrid sturgeon)中分離到海分枝桿菌ITM06-3844。然而, 中華鱘(Acipenser sinensis)、史氏鱘(Acipenser schrencki)等鱘分枝桿菌病卻沒有相關報道。

中國作為漁業(yè)養(yǎng)殖大國, 漁業(yè)的健康養(yǎng)殖與經(jīng)濟發(fā)展息息相關。近年來中華鱘、史氏鱘、雜交鱘(hybrid sturgeon: A. baeri-A. gueldenstaedtii)、西伯利亞鱘(Acipenser baeri)等在中國已經(jīng)大規(guī)模養(yǎng)殖, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有十分重要的地位。在過去的十年中,中國是世界上鱘產(chǎn)量最大的國家[11,12]。隨著鱘的高度集約化人工養(yǎng)殖, 相關的疾病給鱘養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[13,14]。2009—2010年, 我國湖北省宜昌市人工養(yǎng)殖的史氏鱘、中華鱘以及江蘇省淮安市人工養(yǎng)殖的雜交鱘均出現(xiàn)了大規(guī)模的死亡, 經(jīng)過癥狀診斷、病原菌的分離培養(yǎng)和分子生物學方法檢測,結果發(fā)現(xiàn)鱘的病原菌是分枝桿菌。本文著重對我國鱘分枝桿菌病的病原生物學進行研究, 以期為今后研究其流行病學和防治對策奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和患病鱘的癥狀

2009—2010年間, 共收集到19條患病鱘?；疾△\分別來自于湖北省宜昌市中華鱘研究所、湖北省宜昌市清江網(wǎng)箱和江蘇省淮安市大棚等 3三個地區(qū)。其中湖北省清江網(wǎng)箱養(yǎng)殖的中華鱘為室外養(yǎng)殖,其他均為室內(nèi)養(yǎng)殖。鱘發(fā)病時的水溫為25—30℃。

對兩年中8批次共19尾患病鱘的觀察發(fā)現(xiàn), 其典型癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)病初期沒有明顯的癥狀特征,發(fā)病晚期表現(xiàn)出體表有斑點狀潰爛(尤其在腹部和鰓蓋), 腹部腫大, 沿壁上浮游動且游動遲緩, 厭食。解剖發(fā)現(xiàn)腹部有大量的腹水, 肝臟有乳白色或淺紅色斑點(圖1A), 脾臟有淤血斑。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

患病鱘的肝臟、脾臟或血液等樣品進行無菌操作分離病原菌。病原菌接種到Lowenstein–Jensen 培養(yǎng)基(Difco, Detroit, MI, USA) 和Middlebrook 7H10 (Difco, Detroit, MI, USA)+OADC的瓊脂培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng), 30°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30d, 為了保持培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的濕度, 首先培養(yǎng)箱的濕度保持在50%以上, 其次用封口膜將平板封口, 每隔3天打開一次。挑取單菌落在Middlebrook 7H10+OADC的瓊脂培養(yǎng)基上進行二次劃線培養(yǎng)以得到純的單克隆菌落。每個樣品選取2—3株菌用來鑒定和保種, 從每個樣品中分離的不同種病原菌中各選一株為代表菌株作進一步研究。

1.3 分離菌株的形態(tài)學和生理生化特征

分枝桿菌選擇性培養(yǎng)基上生長的病原菌首先經(jīng)過Ziehl-Neelsen染色和HE染色, 觀察細菌形態(tài)和Ziehl-Neelsen染色情況, 并觀察細菌的生長速率,色素的產(chǎn)生和生長時間。再對分離菌株進行如下的生理生化測定: 5% NaCl 生長、硝酸鹽還原、Tween-80水解、脲酶活性、接觸酶活性和芳香硫酸酯酶活性。

1.4 細菌基因組DNA的提取

分離菌株的基因組 DNA使用細菌基因組提取試劑盒提取 (天根生化科技有限公司), 使用方法參見試劑盒說明書, 基因組DNA于–20℃保存?zhèn)溆谩８闻K和脾臟組織中細菌的基因組提取方法如下: 取50—100 mg組織樣品加入無菌 PBS稀釋后勻漿, 3000 r/min 離心 1min, 取上清液加入溶菌酶于 37℃消化過夜。然后使用細菌基因組提取試劑盒提取組織中的細菌基因組DNA, 最后將基因組DNA保持于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離菌株的分子生物學鑒定

分離菌株首先通過分枝桿菌屬特異引物進行檢測, 即以細菌基因組 DNA為模板, 分枝桿菌屬通用引物T39和T13 (第一輪PCR)和引物preT43和T531 (第二輪PCR) 進行巢式PCR檢測[15](表1)。陽性菌株進行保守基因 16S rRNA、rpoB和hsp65測序, 所用的引物分別是: 27f和1492r[16]、Myco-F和Myco-R[17]、HspF和HspR[18](表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收, 然后將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa, 日本), 再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α, 最后挑取陽性克隆進行測序分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將上述三個保守基因的序列通過Genbank在線Blastn比對分析, 同時 16S rRNA序列通過 RDP (Ribosomal database project)網(wǎng)站進行比對分析, 經(jīng)過比對分析后選取并下載與分離菌株序列同源性較高的且具有代表性的菌株序列(如ATCC、CIP等典型代表菌株), 然后去除測序基因的引物序列, 并將代表菌株的相應基因序列也截取到與分離菌株基因序列相同的長度。通過Clustal X (1.81) 軟件分別進行多重比對, 再通過MEGA 4.1軟件分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹。最后可以通過分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹來確定分離菌株的種屬關系。

1.7 組織中病原菌的檢測

由于分枝桿菌與其他快速生長的魚類病原菌相比而言較難培養(yǎng), 因為它不僅需要專用培養(yǎng)基, 而且培養(yǎng)時間較長。因此, 為了進一步確定患病鱘的病原菌為分枝桿菌, 檢測樣品組織中的分枝桿菌顯得十分必要。本文通過rpoB文庫法和 PCR-DGGE法對樣品中的病原菌進行檢測。

表1 本文中使用的引物Tab. 1 The primers used in this study

由于分枝桿菌 16S rRNA具有較高的保守性,用于分枝桿菌種的鑒定得到的結果常常不夠理想,相比較而言, 分枝桿菌rpoB在種間具有更高的區(qū)分度, 所以通過PCR擴增樣品組織中的分枝桿菌rpoB (引物為Myco-F和Myco-R)構建rpoB文庫。即PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收, 將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體, 再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α (即構建組織中病原菌rpoB文庫), 最后每個樣品挑取10個陽性克隆進行測序和分析。

其次, 使用PCR-DGGE技術檢測鱘組織樣品中的分枝桿菌多樣性。因為通過構建患病鱘組織中細菌rpoB文庫, 然后進行測序, 雖然可以得到較長的rpoB序列, 但是仍然有可能篩選不到病魚組織中豐度較低的分枝桿菌。而PCR-DGGE方法非常適合用于檢測組織中分枝桿菌的多樣性。以組織中細菌基因組 DNA為模板, 以 F357-GC (F357-GC: 引物F357的5′ 端加上GC夾子5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG-3′)和Myco-600R為引物進行PCR擴增: 94℃預變性4min, 然后94℃變性 0.5min, 56℃退火 0.5min, 每個循環(huán)退火溫度降低0.5℃, 72℃延伸1min, 共10個循環(huán)。接著94℃變性0.5min, 51℃退火0.5min, 72℃延伸1min,共25個循環(huán), 最后72℃終延伸8min。PCR-DGGE 產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳[19]。然后切下所有條帶, 將含有目的條帶的凝膠加入 40 μL TE緩沖液并搗碎, 4℃放置過夜, 以上清液中的DNA作為模板, 進行再次PCR擴增(引物為F357和Myco600R)[20](表1), PCR產(chǎn)物如上所述連接到pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α, 最后挑取陽性克隆測序分析。

最后, 對患病鱘肝臟、脾臟組織病理進行切片檢測。病魚的組織抗酸染色是進一步證實鱘的病原菌是否為分枝桿菌的又一重要手段。通過將新鮮的肝臟、脾臟組織樣品進行 10%的福爾馬林固定, 然后進行HE染色和Ziehl–Neelsen染色觀察組織病理切片[21]。將新鮮的肝臟組織于預冷的2.5%戊二醛中固定, 然后制備透射電鏡樣品, 最后觀察和分析。

1.8 分離菌株對斑馬魚的致病性

斑馬魚被認為是研究分枝桿菌致病機理的模式動物之一[22]。為了獲得不同種分離菌株的致病力,選取13株代表菌株進行斑馬魚的人工感染試驗, 即CST-8.2b、CST-8.29、CST-9.1、ASCy-1.0、ASCw-1.3、HA-1、ASCr-1.1、ASCr-1.5、ASCr-1.6、ASCw-1.7、ASCr-1.41、ASCr-1.42和ASCw-1.43菌株。細菌在7H10+OADC瓊脂培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng), 在無菌PBS中懸浮和稀釋, 然后離心收集菌體, 再用無菌 PBS洗滌一次, 最后計算出菌液濃度(通過測定OD600)。腹腔注射成年斑馬魚, 每尾注射50 μL細菌懸浮液,每組注射16尾健康的斑馬魚(體長約3.5 cm), 對照組斑馬魚每尾人工腹腔注射50 μL無菌PBS。感染組和對照組均分別在相同的條件下飼養(yǎng), 即每組分別在25℃的水溫條件下飼養(yǎng)(裝有18 L水的箱子)。每天早晚定期投喂, 在投喂后每天換新鮮水約 5 L,并做好相關記錄, 連續(xù)觀察 100d。當斑馬魚表現(xiàn)出發(fā)病癥狀時(垂死), 立即進行解剖和病原菌分離,當連續(xù)觀察到 100d時未發(fā)病的斑馬魚也進行病原菌分離。分離菌株的鑒定方法如上所述。

2 結果

2.1 鱘分枝桿菌病的典型病理特征

患病鱘的典型癥狀表現(xiàn)體表有斑點狀潰爛(尤其在腹部和鰓蓋), 腹部腫大, 腹部有大量的腹水,解剖發(fā)現(xiàn)肝臟有乳白色或淺紅色斑點, 脾臟有淤血斑。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)患病鱘的肝臟有典型的肉芽腫, 而且Ziehl–Neelsen染色為陽性(圖1)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)患病鱘的肝臟和脾臟中均有桿狀細菌, 在肝臟中呈現(xiàn)聚集狀, 而且電鏡觀察的結果也表明患病鱘組織中沒有病毒顆粒(圖1)。以上特征符合魚類分枝桿菌病的相關特征。

圖1 患病鱘的肝臟病理特征和病原菌的顯微觀察Fig. 1 Pathological features of diseased Chinese sturgeon and microscopic-observation of the pathogens

2.2 分離菌株的生理生化特征

從患病鱘中分離到49株病原菌, 部分生理生化試驗的結果顯示分離菌株可分為 7種分枝桿菌(表2)。所有的病原菌均表現(xiàn)出分枝桿菌屬的細菌生理生化特征: 需氧、不運動、生長緩慢、Ziehl–Neelsen染色陽性和某些分枝桿菌產(chǎn)生色素等。此外, 按其生長速率可分為速生型分枝桿菌(RGM)和緩慢生長型分枝桿菌(SGM), 按其有無色素的產(chǎn)生又可分為產(chǎn)色分枝桿菌和不產(chǎn)色分枝桿菌(表 2)。我們從 49株分離菌株中選取27株作為代表菌株, 即在每尾患病鱘分離到的病原菌中, 同種病原菌選取一個菌株作為代表菌株進一步研究。

菌株CSTy-8.29、ASCy-1.0、CSTy-9.1、ASCy-1.5、HA-1、ASCr-1.1、ASCr-1.2、ASCr-1.3、ASCr-1.41、ASCr-1.42、ASCr-1.5和 ASCr-1.6屬于緩慢生長型分枝桿菌(需要生長7d以上才能觀察到明顯的菌落),且產(chǎn)生色素。菌株CSTy-8.29、ASCy-1.0、CSTy-9.1和ASCy-1.5在Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基上生長(無光培養(yǎng)條件下)形成的菌落無色素, 當轉(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)時則產(chǎn)生黃色色素。菌株ASCr-1.2、ASCr-1.3、ASCr-1.41、ASCr-1.42、ASCr-1.5和ASCr-1.6在黑暗條件下培養(yǎng)則產(chǎn)生橙黃色色素。其他分離菌株則無論光照培養(yǎng)還是黑暗培養(yǎng)條件下均不產(chǎn)生色素。菌株CST-7.3、CST-7.10、CST-8.2a、CST-8.2b、CST-8.10、CST-8.17、CST-8.29、CST-8.30、CST-8.31、ASCw-1.43、ASCw-1.6、ASCw-1.3和CST-9.1為速生型分枝桿菌, 菌株 ASCw-1.2 和 ASCw-1.7為緩慢生長型分枝桿菌。值得注意的是以上這些菌株中速生型分枝桿菌能夠在 BHIA平板上生長, 緩慢生長型分枝桿菌則不能或生長不良(難形成可見的菌落)。因此, 在使用 BHIA平板分離分枝桿菌時, 通常只能夠分離某些快速生長型分枝桿菌。

2.3 分離菌株的分子生物學鑒定

分離菌株經(jīng)分枝桿菌屬特異引物檢測均為陽性。通過對分離菌株的3個保守基因16S rRNA、rpoB和 hsp65的測序和分析, 然后構建系統(tǒng)發(fā)育樹。分離菌株的 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹的結果表明: 分離菌株CST-7.3、CST-7.10、CST-8.2a、CST-8.2b、CST-8.10、CST-8.17、CST-8.29、CST-8.30、CST-8.31、ASCw-1.43和 ASCw-1.6屬于龜分枝桿菌或膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus); 分離菌株 CSTy-8.29, CSTy-9.1, ASCy-1.0和ASCy-1.5屬于海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans); 分離菌株HA-1、ASCr-1.1、ASCr-1.2、ASCr-1.3和ASCr-1.42屬于戈登分枝桿菌; 分離菌株ASCr-1.41、ASCr-1.5和ASCr-1.6屬于蘇爾加分枝桿菌; 分離菌株ASCw-1.2和ASCw-1.7屬于M. arupense; 分離菌株ASCw-1.3屬于偶發(fā)分枝桿菌; 分離菌株 CST-9.1 屬于豬分枝桿菌(Mycobacterium porcinum) (圖2A)。

通過 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹的分析, 結果發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌不易區(qū)分。海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的基因組比較研究發(fā)現(xiàn)它們有 4000多個共同的基因, 它們的基因組相似度高達98.3%[28]。然而, 研究發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌 16S rRNA的3′ 端序列存在變異區(qū), 這一差異常常被用于作為區(qū)分它們的一種標準[29]。序列比對發(fā)現(xiàn)分離菌株CSTy-8.29、CSTy-9.1、ASCy-1.0和ASCy-1.5的16S rRNA序列在1249 bp位點處同海分枝桿菌的相同, 即為“A”堿基; 在1450—1452 bp位點處缺失“CTTT”四個堿基, 這與海分枝桿菌的16S rRNA序列相同。所以, 分離菌株 CSTy-8.29、CSTy-9.1、ASCy-1.0和ASCy-1.5屬于海分枝桿菌。

表2 分枝桿菌分離菌株的幾種關鍵生化特征Tab. 2 Key biochemical characteristics of Mycobacterium strains isolated from the diseased sturgeons

為了對分離菌株更為準確的鑒定, 又構建了rpoB (圖2B)和hsp65 (圖2C)的系統(tǒng)發(fā)育樹。通過分析這兩個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹, 結果表明分離菌株CST-7.3、CST-7.10、CST-8.2a、CST-8.2b、CST-8.10、CST-8.17、CST-8.29、CST-8.30、CST-8.31、ASCw-1.43和 ASCw-1.6屬于龜分枝桿菌, 而其他分離菌株的鑒定結果表明同以上的鑒定結果相同。分離菌株的生理生化測定結果同樣支持分子生物學鑒定的結果,這表明從患病鱘中分離到的分枝桿菌有 7種, 分別是: 海分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、豬分枝桿菌和 M. arupense (表3)。

2.4 鱘組織中分枝桿菌的分子生物學檢測

鱘組織的分枝桿菌 rpoB文庫測序結果表明除了014和016號鱘樣品, 其他鱘組織樣品中均檢測到了與已分離的海分枝桿菌 rpoB完全相同的序列,而且該種序列在文庫中所占測序的克隆數(shù)比例通常較高, 這表明海分枝桿菌存在于多個鱘組織樣品中。而在樣品010號中只發(fā)現(xiàn)與海分枝桿菌rpoB序列相同的rpoB序列, 這表明該鱘組織中可能只有一種海分枝桿菌。其他分離菌株的rpoB序列在相應的鱘組織樣品的rpoB文庫中也均被發(fā)現(xiàn)。這表明在部分鱘樣品中, 雖然沒有分離到海分枝桿菌, 但是在患病鱘組織中檢測到了海分枝桿菌的存在。

PCR-DGGE電泳的條帶顯示檢測樣品中產(chǎn)生有1—3個電泳條帶, 對每個電泳產(chǎn)生的每個條帶進行切膠回收, 然后通過測序分析。測序結果表明除了樣品014和樣品016外所有鱘組織樣品中均含有與海分枝桿菌16S rRNA序列相同的序列。并且在這些樣品中也發(fā)現(xiàn)了相應分離菌株的16S rRNA序列。通過構建rpoB文庫和PCR-DGGE方法的測序分析,結果表明所有已經(jīng)分離的菌株在相應的組織中都能夠檢測到。雖然在一些鱘組織樣品中未分離到海分枝桿菌, 但是可以檢測到海分枝桿菌。rpoB文庫和PCR-DGGE的結果也表明患病鱘為分枝桿菌復合感染, 而在復合感染中海分枝桿菌最為流行, 因為其存在于絕大多數(shù)樣品中(表3)。

圖2 患病鱘分離菌株與其他相關代表菌株的16S rRNA (A)、rpoB (B)和hsp65 (C)系統(tǒng)進化樹分析(NJ法構建)Fig. 2 Phylogenetic trees based on sequences of 16S rRNA (A), rpoB (B) and hsp65 (C) constructed using the neighbor-joining method, which shows the relationships between isolates and other related species of Mycobacterium. Bootstrap was replicated 1000 times; only the values >50% are given at nodes

2.5 分枝桿菌對斑馬魚的致病性

選取 13株分枝桿菌為代表菌株對斑馬魚腹腔注射感染試驗(表4), 結果表明海分枝桿菌的致死率最高, 當腹腔注射劑量為(5×105) CFU/尾時, 13d后死亡率為100%, 當注射劑量為(5×104) CFU/尾, 16d后死亡率為 100%; 當注射劑量降低為(5×103) CFU/尾時, 28d后死亡率為100%。注射海分枝桿菌10d后表現(xiàn)為皮膚潰爛、消瘦、腹部腫大, 而且能成功分離到海分枝桿菌。其他非海分枝桿菌對斑馬魚的致死率相對較低, 如在注射劑量為(5×105) CFU/尾時, 蘇爾加分枝桿菌和M. arupens對斑馬魚的致死率為50%—62.5%。其他4種分枝桿菌(龜分枝桿菌、豬分枝桿菌、戈登分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌)的致死率為0—37.5%, 明顯低于海分枝桿菌的致死率。注射感染龜分枝桿菌、豬分枝桿菌、戈登分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌斑馬魚在100d時沒有明顯的癥狀出現(xiàn),但是注射的菌株都能夠在100d后分離到(表4)。

3 討論

鱘是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一, 具有十分重要的經(jīng)濟價值。然而, 關于鱘分枝桿菌病知之甚少, 更沒有鱘分枝桿菌復合感染的相關報道。因此,對鱘分枝桿菌病的研究具有十分重要的意義。本文從19條患病鱘(中華鱘、史氏鱘和雜交鱘)中分離到了 49株分枝桿菌, 通過傳統(tǒng)的培分離培養(yǎng)、Ziehl-Neelseen 染色、生理生化特征以及16S rRNA、rpoB和hsp65的親緣關系進化樹來確定病原菌的種屬關系。鑒定結果表明在患病鱘中分離到海分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、豬分枝桿菌和M. arupense 7種分枝桿菌。

分析兩年期間3個不同區(qū)域的患病鱘中分離到的分枝桿菌可知: 19條鱘中11條鱘分離出龜分枝桿菌(57.9%), 5條鱘分離出戈登分枝桿菌(26.3%), 4條鱘分離到海分枝桿菌(21.1%), 3條鱘分離出蘇爾加分枝桿菌(15.8%), 2條鱘分離出M. arupense (10.5%), 1條鱘分離出偶發(fā)分枝桿菌(5%), 1條鱘分離出豬分枝桿菌(5%)。分離菌株中龜分枝桿菌的比例最高,而偶發(fā)分枝桿菌和豬分枝桿菌的比例最低(5%)。分離的結果表明在19條鱘中7條鱘為分枝桿菌復合感染(36.8%)。然而, 患病鱘組織中的病原菌分子生物學檢測結果表明19條鱘中17條鱘(89.5%)檢測到海分枝桿菌, 18條鱘(94.7%)為分枝桿菌復合感染。這與病原菌分離的結果不同, 海分枝桿菌的檢出率明顯高于分離的結果, 鱘復合感染的比例也明顯提高。導致這一差異的原因在于部分樣品中沒有成功分離到海分枝桿菌卻檢測到海分枝桿菌, 這或許是因為在病原菌分離之前病魚使用了某些抗生素(如恩諾沙星和氟苯尼考)所致, 或者因為其他未知原因?qū)е潞７种U菌培養(yǎng)為陰性。因此, 這提示我們在診斷魚類分枝桿菌疾病時, 尤其是緩慢生長型的分枝桿菌, 不僅要注重病原菌的分離培養(yǎng), 分子生物學診斷也十分重要。通過鱘分枝桿菌病的診斷和分析, 結果表明海分枝桿菌最為流行, 其次是龜分枝桿菌, 這一結果不同于同 Zanoni, et al.[30]的研究結果, 他們在觀賞魚分枝桿菌病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)龜分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌比海分枝桿菌更加流行, 這或許是因為不同宿主的原因所致。

表3 分枝桿菌代表菌株信息Tab. 3 Details of the representative mycobacterial isolates collected in this study

表4 分離菌株對斑馬魚的攻毒試驗結果Tab. 4 Virulence assay of the representative Mycobacterium isolates against zebrafish intraperitoneally injected (N=16 for each group)

鱘可以被多種分枝桿菌感染。分離培養(yǎng)和分子生物學診斷結果均表明患病鱘存在分枝桿菌復合感染, 而且分子生物學診斷的結果顯示分枝桿菌復合感染是患病鱘主要感染方式, 這種現(xiàn)象在魚類分枝桿菌病中尚未見報道。雖然在魚類分枝桿菌病中,分枝桿菌的復合感染也時常被報道, 如Cacatoo Dwarf Cichlid[31]、鳳尾短鯛(Apistogramma cacatuoides)[32]、珍珠馬甲(Trichogaster leeri)[30]、觀賞魚[9]等魚類中均發(fā)現(xiàn)分枝桿菌復合感染, 但是, 令人驚奇的是本研究結果表明鱘分枝桿菌復合感染具有非常高的比例(94.7%)。這提示我們今后在鱘分枝桿菌病的診斷和防治時應注意分枝桿菌的復合感染情況。

目前, 魚類分枝桿菌對斑馬魚的致病性研究很少有報道, 而且主要集中在海分枝桿菌對斑馬魚的致病力研究。本研究分離菌株對斑馬魚的攻毒試驗結果表明, 海分枝桿菌的致病力最強(100%), 蘇爾加分枝桿菌和 M. arupense對斑馬魚的毒力次之(50%— 62.5%), 偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌、豬分枝桿菌和龜分枝桿菌對斑馬魚的毒力最弱(0—37.5%)。這與Watral, et al.[33]的研究結果相似,即認為RGM是能夠造成有長期的、亞致死的感染。值得注意的是, 本研究中發(fā)現(xiàn)復合感染的比例非常高, 這或許表明多種分枝桿菌共同感染或許可以提高它們的致病力, 因為我們在研究中也發(fā)現(xiàn)雖然單一非海分枝桿菌對斑馬魚的致病力不高, 而復合感染的致病力則會大大提高(結果未顯示)。這一現(xiàn)象在一定程度上解釋了為何在鱘中發(fā)現(xiàn)了如此高比例的分枝桿菌復合感染。在鱘分枝桿菌病中, 海分枝桿菌不僅檢出的比例最高, 而且毒力最強, 因此,海分枝桿菌可能是鱘分枝桿菌復合感染過程中主要的致病菌。

魚類中的分枝桿菌對人有一定的致病性。例如, Feng, et al.[34]在江蘇省海安縣發(fā)現(xiàn)有漁民感染海分枝桿菌。Slany, et al.[35]也發(fā)現(xiàn)從事漁業(yè)的人員感染海分枝桿菌, 尤其是導致皮膚感染。豬分枝桿菌常導致豬的下頜下淋巴炎, 并且能夠在人和水環(huán)境中分離到[36,37]。Mycobacterium arupense多次在人的臨床樣品中被分離到[38—40]。有趣的是, 本研究在鱘中也分離到豬分枝桿菌和M. arupense。這提示我們魚源分枝桿菌對人類的健康也存在威脅。因而, 深入研究鱘分枝桿菌病對鱘的健康養(yǎng)殖具有十分重要的意義。

[1] Nigrelli R F, Vogel H. Spontaneous tuberculosis in fishes and in other cold-blooded vertebrates with special reference to Mycobacterium fortuitum Cruz from fish and human lesions [J]. Zoologica, 1963, 48(9): 131—143

[2] Gauthier D T, Rhodes M W. Mycobacteriosis in fishes: a review [J]. The Veterinary Journal, 2009, 180(1): 33—47

[3] Falkinham J O. Nontuberculous mycobacteria in the environment [J]. Clinics in Chest Medicine, 2002, 23(3): 529—551

[4] Falkinham J O. Surrounded by mycobacteria: nontuberculous mycobacteria in the human environment [J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 107(2): 356—367

[5] Novotny L, Dvorska L, Lorencova A, et al. Fish: a potential source of bacterial pathogens for human beings [J]. Veterinarni Medicina, 2004, 49(9): 343—358

[6] Ross A J, Brancato F P. Mycobacterium fortuitum Cruz from the tropical fish Hyphessobrycon innesi [J]. Journal of Bacteriology, 1959, 78(3): 392—395

[7] Gauthier D T, Rhodes M W, Vogelbein W K, et al. Experimental mycobacteriosis in striped bass Morone saxatilis [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2003, 54(2): 105—117

[8] Abalain-Colloc M L, Guillerm D, Salun M, et al. Mycobacterium szulgai isolated from a patient, a tropical fish and aquarium water [J]. European Journal of ClinicalMicrobiology and Infectious Diseases, 2003, 22(12): 768—769

[9] Pate M, Jencic V, Zolnir-Dovc M, et al. Detection of mycobacteria in aquarium fish in Slovenia by culture and molecular methods [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2005, 64(1): 29—35

[10] Stragier P, Hermans K, Stinear T, et al. First report of a mycolactone-producing Mycobacterium infection in fish agriculture in Belgium [J]. FEMS Microbiology Letters, 2008, 286(1): 93—95

[11] Wei Q, He J, Yang D, et al. Status of sturgeon aquaculture and sturgeon trade in China: a review based on two recent nationwide surveys [J]. Journal of Applied Ichthyology, 2004, 20: 321—332

[12] Li B R, Zou Y, Wei Q. Sturgeon aquaculture in China: status of current difficulties as well as future strategies based on 2002-2006/2007 surveys in eleven provinces [J]. Journal of Applied Ichthyology, 2009, 25(6): 632—639

[13] Yang W, Li A. Isolation and characterization of Streptococcus dysgagalactiae from diseased Acipenser schrenckii [J]. Aquaculture, 2009, 294: 14—17

[14] Yang Y B, Xia Y T, Zheng W D, et al. Isolation and identification of Yersinia ruckeri from Acipenser baerii and its antibiotic sensitivity [J]. Acta Hydrobiology Sinica, 2013, 37(2): 393—398 [楊移斌, 夏永濤, 鄭衛(wèi)東, 等. 鱘源魯氏耶爾森菌的分離鑒定及藥敏特性研究. 水生生物學報, 2013, 37(2): 393—398]

[15] Talaat A M, Reimschuessel R, Trucksis M. Identification of mycobacteria infecting fish to the species level using polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis [J]. Veterinary Microbiology, 1997, 58(2-4): 229—237

[16] Milinovich G J, Burrell P C, Pollitt C C, et al. Streptococcus henryi sp. nov. and Streptococcus caballi sp. nov., isolated from the hindgut of horses with oligofructose-induced laminitis [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2008, 58(Pt1): 262—266

[17] Adékambi T, Colson P, Drancourt M. rpoB-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(12): 5699—5708

[18] Kim H, Kim S H, Shim T S, et al. Differentiation of Mycobacterium species by analysis of the heat-shock protein 65 gene (hsp65) [J]. International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 2005, 55(Pt4): 1649—1656

[19] Florez A B, Mayo B. Microbial diversity and succession during the manufacture and ripening of traditional, Spanish, blue-veined Cabrales cheese, as determined by PCR-DGGE [J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 110(2): 165—171

[20] Leys NM, Ryngaert A, Bastiaens L, et al. Occurrence and community composition of fast-growing Mycobacterium in soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2005, 51(3): 375—388

[21] Allen J L. A modified Ziehl-Neelsen stain for mycobacteria [J]. Medical Laboratory Science, 1992, 49(2): 99—102

[22] Kanther M, Rawls J F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish [J]. Current Opinion in Immunology, 2010, 22(1): 10—19

[23] Najiah M, Lee K L, Noorasikin H, et al. Phenotypic and genotypic characteristics of Mycobacterium isolates from fighting fish Betta spp. in Malaysia [J]. Research in Veterinary Science, 2011, 91(3): 342—345

[24] Mun H S, Park J H, Kim H, et al. Mycobacterium senuense sp. nov., a slowly growing, non-chromogenic species closely related to the Mycobacterium terrae complex [J]. International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 2008, 58(Pt 3): 641—646

[25] Adékambi T, Stein A, Carvajal J, et al. Description of Mycobacterium conceptionense sp. nov., a Mycobacterium fortuitum group organism isolated from a posttraumatic osteitis inflammation [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2006, 44(4): 1268—1273

[26] Fanti F, Tortoli E, Hall L, et al. Mycobacterium parmense sp. nov. [J]. International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54(Pt 4): 1123—1127

[27] Cloud J L, Meyer J J, Pounder J I, et al. Mycobacterium arupense sp. nov., a non-chromogenic bacterium isolated from clinical specimens [J]. International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56(Pt6): 1413—1418

[28] Pidot S J, Asiedu K, Kaser M, et al. Mycobacterium ulcerans and other mycolactone-producing mycobacteria should be considered a single species [J]. PloS Neglected Tropical Diseases, 2010, 4(7): e663. doi: 10.1371/journal.pntd.0000663

[29] Portaels F, Fonteyne P A, de Beenhouwer H, et al. Variability in 3′end of 16S rRNA sequence of Mycobacterium ulcerans is related to geographic origin of isolates [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(4): 962—965

[30] Zanoni R G, Florio D, Fioravanti ML, et al. Occurrence of Mycobacterium spp. in ornamental fish in Italy [J]. Journal of Fish Diseases, 2008, 31(6): 433—441

[31] Lescenko P, Matlova L, Dvorska L, et al. Mycobacterial infection in aquarium fish [J]. Veterinarni Medicina, 2003, 48(3): 71—78

[32] Novotny L, Halouzka R, Matlova L, et al. Morphology and distribution of granulomatous inflammation in freshwater ornamental fish infected with mycobacteria [J]. Journal of Fish Diseases, 2010, 33(12): 947—955

[33] Watral V, Kent M L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 2007, 145(1): 55—60

[34] Feng Y, Xu H, Wang H, et al. Outbreak of a cutanuousMycobacterium marinum infection in Jiangsu Haian, China [J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases, 2011, 71(3): 267—272

[35] Slany M, Jezek P, Fiserova V, et al. Mycobacterium marinum infections in humans and tracing of its possible environmental sources [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2012, 58(1): 39—44

[36] Taddei R, Barbieri I, Pacciarini M L, et al. Mycobacterium porcinum strains isolated from bovine bulk milk: Implications for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis detection by PCR and culture [J]. Veterinary Microbiology, 2008, 130(3—4): 338—347

[37] Shojaei H, Heidarieh P, Hashemi A, et al. Species identification of neglected nontuberculous mycobacteria in a developing country [J]. Japanese Journal of Infection diseases, 2011, 64(4): 256—271

[38] Masaki T, Ohkusu K, Hata H, et al. Mycobacterium kumamotonense sp. nov. recovered from clinical specimen and the first isolation report of Mycobacterium arupense in Japan: Novel slowly growing, nonchromogenic clinical isolates related to Mycobacterium terrae complex [J]. Microbiology and Immunology, 2006, 50(11): 889—897

[39] Neonakis I K, Gitti Z, Kontos F, et al. Mycobacterium arupense pulmonary infection: antibiotic resistance and restriction fragment length polymorphism analysis [J]. Indian Journal of Medical Microbiology, 2010, 28(2): 173—176

[40] Slany M, Svobodova J, Ettlova A, et al. Mycobacterium arupense among the isolates of non-tuberculous mycobacteria from human, animal and environmental samples [J]. Veterinarni Medicina, 2010, 55(8): 369—376

RESEARCH ON THE MYCOBACTERIOSIS AND ITS PATHOGEN IN STURGEONS

ZHANG De-Feng1,2, LI Ai-Hua1and GONG Xiao-Ning1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Mycobacteriosis in fish is a common chronic progressive disease spread worldwide. Several outbreaks of mycobacteriosis in reared sturgeons occurred in China in year 2009 and 2010, which affected Chinese sturgeon (Acipenser sinensis), Amur sturgeon (Acipenser schrencki) and hybrid sturgeon (Acipenser baeri-Acipenser gueldenstaedtii). Mycobacteria were identified as the pathongens of this disease based on a variety of observation, including the identification of the isolates, the detection of pathogens in tissues, the clinical signs and the histopathological examinations. Forty-nine isolates of nontuberculous mycobacteria were extracted from 19 infected sturgeons. We identified seven species of Mycobacterium from these isolates, namely, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium porcinum, and Mycobacterium arupense. We found that two or three mycobacterial species co-existed in the same tissues. Our results also showed that M. marinum was more prevalent than other mycobacterial species. Virulence assay revealed that M. marinum showed the highest pathogenicity to zebrafish. These results suggested that M. marinum should be the major pathogenic bacteria in sturgeon mycobacteriosis, and that the mixed mycobacterial infection be the predominant form of sturgeon mycobacteriosis. To our best knowledge, this is the first report about the mycobacteriosis in farmed Chinese sturgeons and Amur sturgeons, and is the first report about the isolation of M. porcinum and M. arupense from the infected fish.

Sturgeon; Mycobacterium; Identification; Phylogenetic analysis; Mixed infections

S941

A

1000-3207(2014)03-0495-10

10.7541/2014.70

2013-04-11;

2014-01-21

國家自然科學基金項目(No. 30670112; No. 31070112)資助

張德鋒(1985—), 男, 安徽阜陽人; 在讀博士; 研究方向為魚類病原微生物學。E-mail: zhangdefeng08@126.com

李愛華(1963—), 男, 研究員; E-mail: liaihua@ihb.ac.cn