葛平平陳 林張 維董慶喆劉天中呂雪峰

(1. 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所, 生物燃料重點實驗室, 青島 266101; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

乙醇消耗菌的分離鑒定及其對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響

葛平平1,2陳 林1張 維1董慶喆1劉天中1呂雪峰1

(1. 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所, 生物燃料重點實驗室, 青島 266101; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

為研究產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻培養(yǎng)液中的乙醇消耗菌污染情況及其對乙醇產(chǎn)量的影響, 從污染的培養(yǎng)液中分離出4株乙醇消耗菌, 通過16S rDNA、26S rDNA序列分析對分離出的菌株進行鑒定, 并研究其乙醇消耗能力及對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明, 分離出的 4株菌分別為紅酵母(Rhodotorula sp.)、季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii)、短波單胞菌(Brevundimonas sp.)、微桿菌(Microbacterium sp.)。其中乙醇消耗能力最強的是紅酵母, 乙醇比消耗速率達到 391 g/(1015cfu?d); 其次為季也蒙酵母, 乙醇比消耗速率為80.1 g/(1015cfu?d); 短波單胞菌和微桿菌的乙醇比消耗速率遠低于紅酵母和季也蒙酵母。將分離出的菌株與產(chǎn)乙醇集胞藻共培養(yǎng)7d后, 污染紅酵母、季也蒙酵母、短波單胞菌、微桿菌的實驗組乙醇產(chǎn)量分別下降了 53.8%、23.6%、40.7%、27.3%。4株菌對基因工程集胞藻的生長無明顯影響, 均通過直接消耗乙醇而降低集胞藻的乙醇產(chǎn)量。

乙醇消耗菌; 微生物污染; 生物乙醇; 基因工程集胞藻

生物乙醇是重要的生物液體燃料之一, 可作為汽油替代品或可再生交通燃料添加劑[1]。應(yīng)用基因工程藍藻直接利用太陽能和CO2一步法生物合成乙醇具有獨特的優(yōu)勢, 因此成為各界關(guān)注的熱點[2—5]。目前, 用于生產(chǎn)乙醇的基因工程藍藻主要有聚球藻(Synechococcus sp. PCC 7942)[4]和集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)[3,5]等, 最高乙醇產(chǎn)量達到5.5 g/L[5], 顯示出太陽能生物轉(zhuǎn)化直接合成乙醇的巨大潛力。然而, 有研究表明基因工程集胞藻的乙醇產(chǎn)量很不穩(wěn)定, 在培養(yǎng)后期培養(yǎng)液中的乙醇濃度急劇下降[3,5], 因此研究確定影響乙醇產(chǎn)量穩(wěn)定性的因素對生產(chǎn)工藝的建立有重要意義。

在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn), 基因工程集胞藻在培養(yǎng)過程中易發(fā)生食藻生物和微生物污染, 尤其是在放大培養(yǎng)階段這種污染尤為嚴重。食藻生物會吞食藻細胞, 使生物量迅速下降, 從而降低乙醇產(chǎn)量。自然界中存在著多種能利用乙醇的微生物, 例如醋酸菌、面包酵母、嗜有機甲基桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏醋桿菌、門多薩假單胞菌等都可代謝乙醇[6—11],其中巴氏醋桿菌的乙醇消耗速率達到2.3 mL/d。而在管囊酵母[12]、釀酒酵母[13]中, 乙醇的合成代謝和分解代謝同時存在。如果污染了這些微生物, 也可能嚴重影響乙醇產(chǎn)量。目前, 關(guān)于微生物污染對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響還未有報道。

本研究從污染的產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻的培養(yǎng)液中分離出 4株乙醇消耗菌, 評價各菌的乙醇消耗能力以及對基因工程集胞藻的生長和乙醇產(chǎn)量的影響, 并采用形態(tài)觀察和基因序列分析手段鑒定污染菌的種類, 以期能為藍藻乙醇的培養(yǎng)工藝及污染控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)方法

產(chǎn)乙醇基因工程集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 Syn-ZG25, 由中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所構(gòu)建[5]。集胞藻在250 mL三角搖瓶(裝液量100 mL)或直徑30 mm的氣泡柱式光反應(yīng)器(裝液量200 mL)中培養(yǎng), 通入含5% CO2的空氣混合氣,通氣速率(10±2) L/h, 光強100 μmol/(m2?s), 培養(yǎng)溫度(30±2) ℃。培養(yǎng)基為 BG11培養(yǎng)基, 其中含20 mg/L壯觀霉素(Spectinomycin, Sigma)[14]。

1.2 乙醇消耗菌的分離純化

培養(yǎng)基 (1)初篩培養(yǎng)基: 牛肉膏3 g/L, 蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L, 乙醇2 g/L, 壯觀霉素20 mg/L,瓊脂 15 g/L; (2)復(fù)篩培養(yǎng)基: BG11培養(yǎng)基中添加2 g/L的乙醇, 20 mg/L的壯觀霉素, 15 g/L的瓊脂; (3)純化培養(yǎng)基: 牛肉膏 3 g/L, 蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L, 乙醇 2 g/L, 瓊脂 15 g/L; (4)發(fā)酵培養(yǎng)基: 牛肉膏 3 g/L, 蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L, 乙醇 2.3 g/L,壯觀霉素 20 mg/L。

乙醇消耗菌的分離及純化 (1)初篩: 集胞藻在氣泡柱式反應(yīng)器中通氣培養(yǎng) 12—14d后, 經(jīng)無菌檢測為陽性, 作為染菌藻液。取染菌的Syn-ZG25藻液,經(jīng)梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平板上, 置于 30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板上有單菌落長出后, 依據(jù)菌落形態(tài)和顯微觀察結(jié)果, 分別挑取多株菌落形態(tài)和顯微形態(tài)相同的單菌落培養(yǎng)。(2)復(fù)篩: 將初篩得到的各菌株分別在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上劃線或涂布, 平板放置于 30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7—10d,長出的菌株在純化培養(yǎng)基平板上經(jīng)多次傳代后作為復(fù)篩菌株。

1.3 乙醇消耗菌的鑒定

菌落及個體形態(tài)觀察 在純化培養(yǎng)基平板上,利用目測法觀察乙醇消耗菌的菌落形態(tài)。挑取純化后的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中, 培養(yǎng) 24h后取適量菌液低速離心, 收集菌體, 依次使用 2.5%戊二醛溶液和 1%鋨酸固定, 經(jīng)乙醇梯度脫水后噴金處理,然后用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800型, 日本Hitachi公司)進行個體形態(tài)觀察。

乙醇消耗菌的16S rDNA及26S rDNA序列測定根據(jù)各菌的菌落和個體形態(tài)分析, 4種菌可能分屬細菌和酵母兩大類, 因此同時進行了16S rDNA及26S rDNA序列測定。引物設(shè)計: 分別選用16S rDNA通用引物對 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/ 1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)以及26S rDNA通用引物對NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA AAAG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR反應(yīng)體系與條件: PCR反應(yīng)采用50 μL體系, 以提取的基因組 DNA為模板, 用高保真 Taq酶進行PCR擴增。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 5min; 94 ℃ 30s, 55℃1min, 72 ℃ 1min, 34個循環(huán); 72 ℃ 10min 。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。目的基因片段克隆: 將PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(Cycle-Pure Kit,美國Omega公司)進行純化, 產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細胞中, 涂布到Amp抗性平板上培養(yǎng)9—16h。挑取3個單克隆,擴繁后送上海桑尼生物科技有限公司測序, 將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進行比對和同源性分析。

1.4 乙醇消耗菌的生長及乙醇消耗速率測定

乙醇消耗菌生長曲線的測定 挑取純化后的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h, 取適量培養(yǎng)液在 660 nm下測定其吸光度(A660), 然后稀釋至A660= 0.05, 按10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中, 于30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng), 定時取樣測定菌液A660。每實驗組設(shè) 2個平行, 對照組中接種等體積的無菌培養(yǎng)液。

菌液細胞濃度的確定 取生長至對數(shù)期的菌液,測定其 A660。梯度稀釋后采用平板活菌計數(shù)法測定細胞濃度, 計數(shù)時僅選取菌落數(shù)在20—200的平板,每株菌每濃度做3個平行。用Origin擬合出菌液A660與細胞濃度D (Cell density, cfu/mL)的關(guān)系, 結(jié)果列入表1。

表1 各菌菌液A660與其細胞濃度D的關(guān)系Tab. 1 Relationship between A660and cell density

乙醇消耗速率的測定 將培養(yǎng)18—24h后的各菌接種到裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中, 根據(jù)擬合得到的公式將培養(yǎng)液適當稀釋, 使其初始細胞濃度維持在106cfu/mL, 將錐形瓶置于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。以不接菌實驗組為對照, 每組實驗設(shè) 2個平行。每6h取樣測定細胞濃度, 并用生物傳感分析儀(SBA-40D, 山東省科學(xué)院生物研究所)測定培養(yǎng)液中乙醇濃度[14]。

乙醇的比消耗速率按公式(1)計算:

其中, Q為比消耗速率, 單位為g/(cfu?d); Ct1表示t1時刻的乙醇濃度, 單位為g/L;D為 t1到 t2時間段內(nèi)的平均細胞濃度, 按照公式(2)計算:

1.5 乙醇消耗菌對基因工程集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響

無菌藻種在三角瓶中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后, 接種于氣泡柱式光生物反應(yīng)器(裝液量200 mL)中, 每24h取樣, 測定藻液的葉綠素a含量及乙醇濃度。自培養(yǎng)第 4天始, 向各實驗組中分別接種稀釋至一定細胞濃度的菌液2 mL, 使各乙醇消耗菌細胞終濃度為106cfu/mL, 對照組加入2 mL無菌水; 每組實驗設(shè)2個平行。每24h取樣, 測定藻液的葉綠素a含量及乙醇濃度。對照組及實驗組每48h作無菌檢測和采用平板活菌計數(shù)法測定菌的細胞密度。

1.6 基因工程集胞藻生長的測定

考慮到乙醇消耗菌在730 nm處也有光吸收, 因此以葉綠素a的含量計量集胞藻的生物量。取1 mL藻液, 離心收集藻細胞, 再加入1 mL甲醇重懸浸泡, 60℃水浴避光提取30min, 離心取上清液測定665 nm下的吸光度, 計算葉綠素a含量[15]。

1.7 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法, 使用SPSS 11.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 乙醇消耗菌的分離及鑒定

從污染的基因工程集胞藻培養(yǎng)液中, 經(jīng)過初篩、多次純化及復(fù)篩, 得到 4株具有乙醇消耗能力的菌,分別編號為GR13、GW13、GT17、GY22。四株菌分別在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5d后的菌落特征列入表2。

表2 四株乙醇消耗菌的菌落特征Tab. 2 Colony characteristics of the four ethanol consuming microorganisms

掃描電鏡觀察顯示(圖1), GR13菌的細胞為球形或橢球形,細胞直徑約2—4 μm; GW13菌的細胞呈卵球形, 長度約 1.5—3 μm, GT17菌的細胞呈桿狀, 直徑約為0.3 μm, 長度約1—2 μm。GY22菌的細胞呈短桿狀, 直徑約 0.3—0.4 μm, 長度約 0.8—1.2 μm。綜合考慮四株菌的菌落和個體形態(tài), 初步認為GR13和GW13屬于酵母菌, GT17和GY22屬于細菌。隨后分別提取各菌的DNA, 并進行16S rDNA及26S rDNA序列測定, 將測得的序列在Genbank BLAST進行同源性比對(表3)。

圖1 四株乙醇消耗菌的個體形態(tài)Fig. 1 The morphology of the four ethanol consuming microorganisms

表3 四株乙醇消耗菌的同源性比對結(jié)果Tab. 3 BLAST results of the four ethanol consuming microorganisms

從比對結(jié)果可以看出, 菌株GR13、GT17、GW13、GY22分別與黏質(zhì)紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta ATCC 11568)、季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii strain KAML05)、人型微桿菌(Microbacterium hominis strain DSM 12509)同源性最高。

2.2 乙醇消耗菌的生長及乙醇消耗能力評價

在發(fā)酵培養(yǎng)基中, 測定四株乙醇消耗菌的生長速率(圖2)。從圖中可以看出, 菌株GW13在0—6h為遲滯期, 6—27h為對數(shù)生長期, 之后生長速度開始減緩并進入穩(wěn)定生長期; 菌株 GR13的對數(shù)生長期能夠持續(xù)更長時間, 至 42h后進入穩(wěn)定生長期;而菌株GT17的對數(shù)生長期僅持續(xù)18h。菌株GY22在整個實驗周期內(nèi)一直勻速生長, 沒有出現(xiàn)明顯的穩(wěn)定生長期。

圖2 四株乙醇消耗菌的生長曲線Fig. 2 Growth curves of the four ethanol consuming microorganisms

4株菌的初始接種濃度均為 106cfu/mL, 在此條件下, 發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度變化見圖3。其中,對照組由于自然揮發(fā)的原因, 乙醇濃度略有下降。在扣除因自然揮發(fā)而消耗的乙醇后, 除了GY22外,其他三個實驗組中的乙醇濃度均顯著下降(P< 0.01)。其中乙醇消耗最快的為GW13菌株, 乙醇消耗速率達到2.05 g/(L?d); 其次為GR13、GT17, 消耗速率分別為1.7 g/(L?d)和0.725 g/(L?d); GY22菌株的乙醇消耗速率最低, 為0.025 g/(L?d)。目前文獻報道的基因工程藍藻的乙醇產(chǎn)率最高為 0.21 g/(L?d)[5],而本研究發(fā)現(xiàn)的三株乙醇消耗菌(GW13、GR13和GT17), 在本研究所設(shè)定的菌細胞濃度下, 其乙醇消耗速率均高于報道的最高乙醇產(chǎn)率, 都能將該濃度的乙醇消耗殆盡。即使是乙醇消耗速率最低的GY22菌株也將使乙醇產(chǎn)量下降約 8%。但是因為該菌株(GY22)在 48h后仍保持生長(圖2), 其細胞濃度可能隨時間延長而累積增加, 也可能消耗更多的乙醇。

圖4顯示菌液濃度的變化, 與圖3對比可以發(fā)現(xiàn), 乙醇消耗速率是與培養(yǎng)液中細菌濃度相關(guān)的。為了更清楚地研究各菌的乙醇消耗能力, 我們分別計算了四株菌的乙醇比消耗速率(圖5)。從圖中可以看出, GR13的乙醇消耗能力最強, 達到 391 g/(1015cfu?d); 其次為 GW13, 乙醇比消耗速率為80.1 g/(1015cfu?d); GT17、GY22的乙醇比消耗速率分別為0.44 g/(1015cfu?d)和0.43 g/(1015cfu?d), 遠低于GR13和GW13兩株菌。

圖3 四株菌的乙醇消耗情況Fig. 3 Ethanol consuming condition of four microorganisms

圖4 四株乙醇消耗菌在發(fā)酵液中的生長Fig. 4 Growth of four ethanol consuming microorganisms

圖5 四株菌的乙醇比消耗速率Fig. 5 Specific ethanol consumption rates of the four microorganisms

2.3 四株乙醇消耗菌對基因工程集胞藻的生長及乙醇產(chǎn)量的影響

向無菌集胞藻培養(yǎng)液中分別加入不同的乙醇消耗菌, 使各菌的終濃度均為106cfu/mL。結(jié)果表明,各實驗組在污染乙醇消耗菌后, 乙醇積累速率開始減緩, 而對照組的乙醇產(chǎn)量仍快速增長(圖6)。在培養(yǎng)7d(接種乙醇消耗菌3d)后, 污染GR13菌的實驗組乙醇濃度開始下降, 污染 GT17、GW13、GY22菌株的實驗組均在第8天時開始下降。培養(yǎng)至第11天時, 污染GR13、GT17、GW13、GY22菌株的實驗組乙醇濃度分別降至對照組的 46.2%、59.3%、76.4%和72.7%。此外, 由圖6計算可知, 第11天時,污染GR13、GT17、GW13、GY22菌株的實驗組中平均乙醇消耗速率分別為 0.051、0.038、0.022和0.026 g/(L?d)。與發(fā)酵培養(yǎng)基中的測定結(jié)果(圖3)相比, GR13、GT17、GW13三個實驗組的乙醇消耗速率均有所降低, 但仍然導(dǎo)致污染乙醇消耗菌的培養(yǎng)液中乙醇濃度明顯下降。相比于發(fā)酵培養(yǎng)基, 集胞藻培養(yǎng)液中營養(yǎng)相對缺乏, 乙醇消耗菌的生長速度相對緩慢(第11天時, 菌細胞濃度約為 107cfu/mL,遠低于發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度), 因此乙醇消耗速率有所降低。

圖6 各菌對集胞藻乙醇產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effects of the four microorganisms on ethanol production of Synechocystis sp.

為考察污染微生物對集胞藻生長的影響, 以葉綠素a來計量培養(yǎng)過程中集胞藻生物量的變化。結(jié)果表明, 在污染乙醇消耗菌后, 實驗組和對照組中集胞藻的生物量都保持同等速率的增長(圖7), 各實驗組間無明顯差異(P>0.05)。由此可見, 在本實驗條件下, 4株菌的存在雖然明顯降低培養(yǎng)液中乙醇濃度(圖6), 但對基因工程集胞藻的生長并無明顯影響, 據(jù)此也能推測乙醇濃度的降低主要是由于污染的乙醇消耗菌對乙醇的直接消耗。

圖7 四株乙醇消耗菌對集胞藻生長的影響Fig. 7 Effects of the four microorganisms on growth of Synechocystis sp.

3 討論

基因工程集胞藻是在野生型集胞藻PCC 6803中轉(zhuǎn)入表達丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的基因, 構(gòu)建出乙醇合成途徑, 通過光合作用固定CO2直接合成乙醇。研究表明, 有很多種因素會影響乙醇合成途徑中關(guān)鍵酶的活性, 從而影響藻細胞的乙醇產(chǎn)率。Gao, et al.的研究結(jié)果表明當培養(yǎng)基中存在較高濃度的Zn2+、Co2+等金屬離子時, 乙醇脫氫酶的活性受抑制[5]。Lan, et al.發(fā)現(xiàn)富氧條件下相關(guān)酶的活性受抑制, 相應(yīng)地, 藻細胞的產(chǎn)醇能力降低[16]。但在Dexer, et al.、Gao, et al.的研究中即使在上述抑制因素并不存在的情況下, 集胞藻培養(yǎng)液中的乙醇積累量仍然表現(xiàn)出快速下降的現(xiàn)象[3,5]。Gao, et al.認為因藻細胞的衰老而引起的乙醇產(chǎn)率降低是乙醇積累量迅速下降的主要原因[5]。而本研究發(fā)現(xiàn)即使在生長末期藻細胞不產(chǎn)生乙醇, 自然揮發(fā)也只是導(dǎo)致乙醇濃度略微下降(圖3)。Dexer, et al.猜測是乙醇脫氫酶反向催化乙醇轉(zhuǎn)變成乙醛, 但沒有闡明導(dǎo)致代謝方向轉(zhuǎn)變的原因[3]。

基因工程集胞藻的目的產(chǎn)物乙醇可通過自由擴散透過原生質(zhì)膜, 直接分泌到胞外, 從而在培養(yǎng)液中積累一定濃度的乙醇。從產(chǎn)物回收的角度看, 從培養(yǎng)液中而非從藻細胞中回收目的產(chǎn)物相對較容易,成本也相應(yīng)降低。而就培養(yǎng)本身而言, 乙醇的積累可能對藻細胞產(chǎn)生脅迫或?qū)е屡囵B(yǎng)液中滋生乙醇消耗菌。K?m?r?inen, et al. 的研究證明培養(yǎng)液中乙醇濃度為4.5 g/L時, 可以對集胞藻PCC6803的生長產(chǎn)生明顯抑制, 導(dǎo)致最高細胞濃度下降4.5%[17]。本研究發(fā)現(xiàn)基因工程集胞藻在培養(yǎng)過程中容易染菌, 并從中分離出4株能夠代謝乙醇的菌(表2, 3)。圖7的結(jié)果表明, 4株菌在BG11培養(yǎng)液中均表現(xiàn)出明顯的乙醇消耗能力, GR13、GW13、GT17、GY22的乙醇消耗速率分別為0.051、0.022、0.038和0.026 g/(L?d), 在營養(yǎng)更豐富的發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇消耗速率更高,分別達到1.7、2.05、0.725和0.025 g/(L?d) (圖3)。在本研究中使用的基因工程藻株Synechocystis sp. PCC 6803 Syn-ZG25的乙醇產(chǎn)率為0.009—0.104 g/(L?d),與上述分離的菌株共培養(yǎng)7d后, 實驗組的乙醇產(chǎn)量均顯著低于無菌對照組(圖6)。當培養(yǎng)液中無乙醇消耗菌時, 乙醇產(chǎn)量呈現(xiàn)增長趨勢; 當培養(yǎng)液中污染少量乙醇消耗菌時, 乙醇積累速度減緩。隨著培養(yǎng)液中乙醇消耗菌濃度的增加, 污染乙醇消耗速率較低的雜菌的實驗組, 乙醇濃度不再增長; 污染乙醇消耗速率較快的雜菌的實驗組, 乙醇濃度迅速下降。在本研究中菌株GR13的乙醇消耗能力最強, 其乙醇比消耗速率為391 g/(1015cfu?d)。目前報道的基因工程藍藻的最高乙醇產(chǎn)量為0.21 g/(L?d)[5], 據(jù)此計算, 若要將菌株GR13對乙醇產(chǎn)量的影響控制在1%以內(nèi), 則其最高細胞濃度應(yīng)控制在5.37×106cfu/mL以內(nèi)。

一些研究表明, 某些細菌能通過分泌溶藻物質(zhì),直接破壞藻細胞[18]; 或者與藻細胞競爭營養(yǎng)和光照而抑制藻細胞的生長。而本研究中分離到的4株乙醇消耗菌與基因工程集胞藻共培養(yǎng)時, 并未對集胞藻的生長產(chǎn)生明顯抑制(圖7), 而與此同時, 培養(yǎng)液中乙醇的積累量出現(xiàn)明顯差異, 說明本研究中的幾株乙醇消耗菌并非通過抑制藻細胞的生理狀態(tài)而影響其乙醇產(chǎn)量, 而是通過消耗產(chǎn)物乙醇而導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量的降低。

經(jīng)形態(tài)和分子鑒定, 本研究中分離的4株菌分別屬于紅酵母屬、季也蒙酵母屬、短波單胞菌屬和微桿菌屬。Okada, et al.、Verduyn, et al.的研究表明[19,20], 某些酵母兼有生產(chǎn)和消耗乙醇的能力, 兩種代謝的方向取決于培養(yǎng)液中可利用糖的濃度, 當培養(yǎng)液中糖濃度較高時, 酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇; 當培養(yǎng)液中糖濃度較低時, 酵母就會消耗乙醇。而產(chǎn)乙醇集胞藻培養(yǎng)使用無機培養(yǎng)基, 有機碳相對匱乏, 因此污染的酵母可能從發(fā)酵產(chǎn)乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橄囊掖?從而降低培養(yǎng)液中的乙醇積累量。本研究還發(fā)現(xiàn),短波單胞菌和微桿菌也能夠消耗乙醇, 有文獻報道顯示短波單胞菌能夠代謝利用乙醇[21], 而微桿菌消耗乙醇的報道還不多見。

在規(guī)模培養(yǎng)中, 由于反應(yīng)器的非完全密閉性、培養(yǎng)環(huán)節(jié)眾多和培養(yǎng)周期較長等原因, 很難做到絕對避免菌的污染。而且在不同培養(yǎng)情況下, 污染菌株的種類和對目標藻類和目標產(chǎn)物的影響機制也各有不同。本研究分離出的幾株菌廣泛存在于環(huán)境中,容易造成規(guī)模培養(yǎng)中的污染并大量消耗乙醇而影響乙醇產(chǎn)量, 尤其是短波單胞菌、微桿菌因為體積微小(直徑約為 0.3 μm), 容易通過用于制備無菌空氣的過濾器而造成污染, 在未來的研究和生產(chǎn)中應(yīng)該加以重視。因此, 本研究通過對幾株乙醇消耗菌的分離鑒定并評價其乙醇消耗速率, 有益于人們了解基因工程集胞藻培養(yǎng)過程中乙醇產(chǎn)量下降的原因, 也有助于認識微藻培養(yǎng)中污染菌的性狀和污染途徑,并就此可進一步發(fā)展針對性的污染控制方法。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ETHANOL CONSUMING MICROORGANISMS AND IMPACT ON ETHANOL PRODUCTION OF GENETICALLY ENGINEERED SYNECHOCYSTIS SP.

GE Ping-Ping1,2, CHEN Lin1, ZHANG Wei1, DONG Qing-Zhe1, LIU Tian-Zhong1and Lü Xue-Feng1
(1. Key Lab. Biofuel, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Four ethanol consuming microorganisms (GR13, GW13, GT17, and GY22) were isolated from the contaminated culture of genetically engineered Synechocystis sp. and were utilized to evaluate the effects of these microorganisms on the ethanol consuming capabilities and ethanol productions of Synechocystis sp. Based on the morphological characteristics and 16S rDNA and 26S rDNA gene sequence, the four strains were identified as Rhodotorula sp., Meyerozyma sp., Brevundimonas sp., and Microbacterium sp., respectively. We observed that strain GR13 (Rhodotorula sp.) had the highest level of specific ethanol consumption rate [391 g/(1015cfu?d)], followed by strain GW13 (Meyerozyma sp., [ 80.1 g/(1015cfu?d)]. While strains GT17 (Brevundimonas sp.) and GY22 (Microbacterium sp.) had much lower ethanol consumption rate. All four strains did not significantly affect the growth of Synechocystis sp., however, they remarkably decreased the ethanol production of Synechocystis sp. The results of the co-culture experiment demonstrated that strains GR13, GW13, GT17, and GY22 diminished ethanol production of the genetically engineered Synechocystis sp. by 53.8%, 23.6%, 40.7% and 27.3%, respectively.

Ethanol consuming microorganism; Microorganism contamination; Bioethanol; Genetically engineered Synechocystis sp.

Q949.22

A

1000-3207(2014)03-0487-08

10.7541/2014.69

2013-04-10;

2013-12-25

國家高技術(shù)發(fā)展計劃(863)(2012AA052103)資助

葛平平(1988—), 女, 河北保定人; 碩士研究生; 主要從事生物化工研究。E-mail: gepp@qibebt.ac.cn

陳林, Tel: 0532-80662737; E-mail: chenlin@qibebt.ac.cn