張小平王一冰鄧 斌鄭佳佳胡彩虹吳學祥李衛(wèi)芬

(1. 浙江大學動物科學學院飼料研究所, 杭州 310058; 2. 貴州大學動物科學學院, 貴陽 550025)

添加不同益生菌對草魚養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響

張小平1王一冰1鄧 斌1鄭佳佳1胡彩虹1吳學祥2李衛(wèi)芬1

(1. 浙江大學動物科學學院飼料研究所, 杭州 310058; 2. 貴州大學動物科學學院, 貴陽 550025)

為評價添加不同益生菌對草魚養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響, 研究采用454焦磷酸測序技術(shù)分析其水體菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明: 添加益生菌后的處理組(枯草芽孢桿菌BS、光合細菌PSB和復合菌CB)其微生物多樣性高于對照組(Control)。在門的水平, Control和CB樣品中變形菌(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌, PSB和BS中變形菌(Proteobacteria)和放線菌(Actinobacteria)所占比例差別不大。與 Control相比, 其他三組中擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)都增加。對變形菌深入分析發(fā)現(xiàn), 在PSB, BS和 CB 樣品中, α-變形桿菌為優(yōu)勢菌, 接下來是β-變形桿菌綱、γ-變形桿菌綱和δ-變形桿菌綱。對擬桿菌分析發(fā)現(xiàn), 除對照外, 其他樣品中黃桿菌綱(Flavobacteria)為優(yōu)勢菌。在對照和處理組中, β-變形桿菌、α-變形桿菌、γ-變形桿菌和擬桿菌門在目的水平組成也有差異。以上結(jié)果表明, 水體中添加益生菌能增加水體菌群多樣性, 改變菌群結(jié)構(gòu)。

益生菌; 草魚; 菌群結(jié)構(gòu); 454焦磷酸測序

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是發(fā)展最快的食品產(chǎn)業(yè), 其產(chǎn)量占世界水產(chǎn)動物產(chǎn)量的44%[1], 它提供高質(zhì)量的動物蛋白, 提升食物營養(yǎng)水平, 并且可在全球范圍內(nèi)提供就業(yè)崗位、增加人民收入[2]。作為世界水產(chǎn)大國,我國同時也是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈產(chǎn)量的國家, 這主要得益于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高。但是集約化生產(chǎn)在提高經(jīng)濟效益的同時也帶來新的問題, 比如, 水產(chǎn)養(yǎng)殖排放的廢水中含有氮化合物(氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮)、磷和難溶的有機碳, 這些物質(zhì)可導致環(huán)境惡化[3,4]。同時, 集約化池塘水質(zhì)的惡化還可增加疾病的發(fā)生率,造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物死亡, 導致嚴重的經(jīng)濟損失[5]。因此, 受污養(yǎng)殖水體治理是目前養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求,也是實現(xiàn)漁業(yè)水體可持續(xù)發(fā)展的必由之路。

目前, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)治理主要包括物理、化學和生物修復等三種方法。與傳統(tǒng)或現(xiàn)代的物理、化學修復方法相比, 生物修復技術(shù)具有操作簡單、高效、費用低, 不會產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點[6—8]。在生物修復技術(shù)中, 有益微生物因其生長繁殖快、比面值大、吸收轉(zhuǎn)化快、適應性強以及種類多、分布廣等優(yōu)勢被廣泛應用[9]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 改善水質(zhì)一般會用到益生菌[10]。微生物之所以可以改善水質(zhì), 是由于他們參與水體中物質(zhì)代謝, 可將有毒的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒害的物質(zhì)。菌群在水處理中發(fā)揮著重要的作用。近年來, 研究者采用一些方法來研究菌群結(jié)構(gòu), 然而, 這些傳統(tǒng)的方法由于其固有的缺陷, 不能完全反應全部菌群信息[8]。新一代測序技術(shù)的出現(xiàn), 可以更全面更準確地描述微生物群落信息[11]。454焦磷酸測序由于其優(yōu)勢目前已被廣泛應用[8,12—14]。本文應用454測序技術(shù)比較了3種益生菌對草魚養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響, 以期為利用微生態(tài)制劑調(diào)控養(yǎng)殖水質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚由浙江紹興縣大畈水產(chǎn)合作社提供; 枯草芽孢桿菌和光合細菌由本實驗室分離得到, 復合益生菌由1株具硝化功能和2株具反硝化功能的枯草芽孢桿菌按等比例混合而成。菌株經(jīng)過發(fā)酵、干燥、混合而制成干菌粉, 所用載體為玉米淀粉。菌含量為109cfu/g。

1.2 方法

實驗設(shè)計 試驗在浙江紹興縣大畈水產(chǎn)合作社進行。草魚用2.5%的食鹽水進行浸泡消毒10min,飼養(yǎng)10d后, 選取草魚228尾, 初始體重約為15 g,隨機分為4組, 每組設(shè)3個重復, 每個重復19尾魚:對照組(Control)在水中不添加任何菌, 處理組每隔7天分別向水中添加枯草芽孢桿(BS) 1 × 109cfu/m3、光合細菌(PSB) 1×1011cfu/m3、復合益生菌(CB) 6 × 108cfu/m3, 所有組飼喂相同質(zhì)量的飼料(表1)。水源為浙江省紹興縣孫端鎮(zhèn)大畈河(經(jīng)緯度: 30°03′38″N, 120°40′52″E)河水。實驗魚在圓形水桶中飼養(yǎng), 養(yǎng)殖實際水體積為340 L, 氧氣泵連續(xù)增氧。每天9: 00和17: 00兩次投餌, 日投餌量為體重的2%。每天觀察魚的活動情況, 實驗時間為15d。

表1 基礎(chǔ)餌料的原料組成和營養(yǎng)成分Tab. 1 Ingredients and nutritional composition of the basal diet

取樣和 DNA提取 在每個桶的同一位置取養(yǎng)殖水體 100 mL, 每組三個平行水樣混合均勻后,經(jīng) SARTORIUS(德國賽多利斯)三聯(lián)微生物濾器0.22 μm過濾, 將含有水樣細菌的濾膜保存于–20℃冰箱。DNA提取按照Zhang, et al.[14]的方法進行。

ROCHE454測序 本實驗使用16S rDNA的V3區(qū)域作為目標DNA序列, 來進行PCR擴增。上游引物: F341 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′, 下游引物 R534 5′-TAGATTACCGCGGCTGCT-3′。在上游引物的 5′端加上了一個 8堿基長的標簽序列,每種特異的標簽序列都對應特異的樣品。使用生工貨物編號為 SK2701的 2×PCR試劑, PCR buffer 10 μL, 引物(20 μmol/L) 0.8 μL, DNA模板50 ng, 滅菌雙蒸水 8.8 μL。PCR反應條件為 94 ℃ 5min, 94 ℃ 40s, 55 ℃ 50s, 72 ℃ 40s, 35個循環(huán), 4 ℃ forever。PCR產(chǎn)物割膠回收, 測定DNA濃度。對于每個樣品的PCR產(chǎn)物, 分別取100 ng等量混合, 送至上海同達科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司進行 454 GS FLX Titanium測序。

測序數(shù)據(jù)分析 所得序列分析方法按照Zhang, et al.[14]進行。將獲得的序列通過Mothur軟件[15], 去除低質(zhì)量的DNA序列、Barcode序列和引物序列。去雜后的數(shù)據(jù)與Sliva數(shù)據(jù)庫[16]比對后, 計算序列之間距離。一個微生物可操作單元(OUT)為序列相似度大于97%的DNA序列。將序列提交至RDP[17]得到每條序列的分類單元, 并利用MEGAN4.7[18]分析軟件, 對對照組和處理組的物種分類進行比較。

2 結(jié)果

采用454高通量測序技術(shù)對水樣中微生物 16S rRNA基因的V3區(qū)進行了測序, 去掉不合格序列之后, 共獲得7830條有效序列。

2.1 菌群多樣性

稀疏曲線分析 圖1為對照組和處理組的稀疏曲線分析結(jié)果, 相同序列數(shù)時處理組比對照組的菌群OUTs高, 表明處理組菌群多樣性高于對照組。其中BS組多樣性最高, 接下來是PSB和CB, 說明在水體中添加益生菌能增加水體菌群多樣性, 但不同菌的影響各不相同。

聚類分析 由圖5可知 , 在PSB和CB聚集后, 再后BS聚為一類。這說明處理組樣品間其細菌群落組成十分相近, 和對照組間有差異。

圖1 稀疏曲線分析圖Fig. 1 Rarefaction results

圖2 對照組和處理組樣品的聚類分析Fig. 2 The similarity of the control and treatment group samples

2.2 菌群組成

從圖3可以看出, 在4個水體樣品中菌群組成輪廓相似, 但各菌所占比例有差異。其中control和CB中變形菌(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌; PSB和BS中變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)所占比例差別不大。與control相比, 其他三組中擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)都增加, 變形桿菌(Proteobacteria)降低。

圖3 水體菌群結(jié)構(gòu)(門水平)Fig. 3 Community structure of culture water by phylum level

對變形菌深入分析發(fā)現(xiàn), 在PSB、BS和 CB 樣品中, α-變形桿菌為優(yōu)勢菌(48.29%—69.36%), 接下來是β-變形桿菌綱(19.28%—38.43%), γ-變形桿菌綱(5.93%—25.43%), 和δ-變形桿菌綱(0.31%— 4.28%) (圖4a); 而在 control中, γ-變形桿菌綱為優(yōu)勢菌(74.43%), 接下來是β-變形桿菌綱(22.42%)、α-變形桿菌綱(2.74%)和δ-變形桿菌綱(0.06%)。擬桿菌分析發(fā)現(xiàn), 在 PSB、BS和 CB 樣品中黃桿菌綱(Flavobacteria)為優(yōu)勢菌, control中優(yōu)勢菌為鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)(圖4b)。

圖4 變形菌門(a)和擬桿菌門(b)組成(綱水平)Fig. 4 Proteobacteria (a) and Bacteroidetes (b) composition by class

由圖5知, β-變形桿菌、α-變形桿菌、γ-變形桿菌和擬桿菌門在目的水平組成也有差異。對β-變形桿菌分析發(fā)現(xiàn), 對照組 Neisseriales(54.43%)和 Burkholderiales(45.05%)是優(yōu)勢菌, 而 PSB、BS和 CB中都是Burkholderiales為優(yōu)勢菌, 分別占83.58%、94.87%和 97.28%。α-變形桿菌分析發(fā)現(xiàn), 對照組中Rhizobiales為優(yōu)勢菌, 緊接著是 Rhodobacterales (21.28%)、Rhodospirillales(19.15%)和 Rickettsiales (12.77%), 而PSB、BS和CB三組中的優(yōu)勢菌各不相同, 分別為 Rhodospirillales (31.60%)、Sphingo-monadales (28.98%)和Rhizobiales (30.76%)。γ-變形桿菌分析發(fā)現(xiàn), 除 PSB外, 其他三組的優(yōu)勢菌均為Chromatiales, 但所占比例各不相同。擬桿菌中, 對照組的優(yōu)勢菌為 Sphingobacteriales (58.33%), 而PSB、BS和 CB三組均為 Flavobacteriales, 所占比例分別為48.56%、73.29% 和38.52%。

利用Megan 4比較水體菌群, 不同的顏色和餅圖大小表該菌在各個樣品中所占比例, 結(jié)果發(fā)現(xiàn),從門到屬的水平 4個樣品中各菌相對豐度不同(圖6)。由圖6可知, 在屬的水平上, 有些是四個樣品共有的菌(如Agrococcus、 Kinneretia等), 有些是三個處理組共有的菌, (如 Flavobacterium、Phenylobacterium、Polynucleobacter等), 每個樣品也有各自特有的菌(如對照組中的 Deinococcus、Virgibacillus和 Pelomonas等, PSB中的 Acidovorax、Alcaligenaceae和 Opitutus等, BS中的 Nakamurella、Jeotgalicoccus和 Roseomonas等, CB中的 Rhizobium、Rubrivivax和Acinetobacter)。

圖5 β-變形桿菌(a)、α-變形桿菌(b)、γ-變形桿菌(c)和擬桿菌門(d)組成(目水平)Fig. 5 β-proteobacteria (a), α-proteobacteria (b), γ-proteobacteria (c) and Bacteroidetes (d) composition by order in different samples

3 討論

水體中微生物的代謝促進了系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動, 維系著一個系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)[19]。 李革雷等[20]指出, 有些菌群具有豐富的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、氧化酶等可以降解不被水生動物或植物利用的大分子有機物, 使其生成二氧化碳、水及其他小分子的物質(zhì); 有些細菌可以改善養(yǎng)殖水質(zhì), 維護有利于水生動物, 尤其是魚蝦的生長的良好環(huán)境;細菌可以產(chǎn)生某種次生代謝產(chǎn)物從而抑制有害細菌和藻類的生長繁殖; 細菌還可以作為生產(chǎn)者將可溶性有機物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白, 從而直接或間接地給水生動物提供營養(yǎng)物質(zhì)在食物鏈中起重要作用。此外,有研究表明, 水體中的細菌對早期腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)起著決定作用; 淡水魚和海水魚腸道中的優(yōu)勢菌分別與淡水和海水水體中的優(yōu)勢菌(好氧和兼性厭氧)類似[21]。因此, 研究養(yǎng)殖水體中的菌群結(jié)構(gòu)具有重要意義。

圖6 MEGAN 4比較不同樣品序列Fig. 6 Sequences from different samples were compared by MEGAN 4

本研究發(fā)現(xiàn), 添加益生菌后可增加水體菌群的多樣性, 這與益生菌的抑菌特性和改善養(yǎng)殖水質(zhì)有關(guān)。芽孢桿菌在水中增殖后產(chǎn)生的許多胞外酶能把養(yǎng)殖水體、底泥中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等有機質(zhì)分解,從而達到維持養(yǎng)殖水生動物消化道微生物的生態(tài)平衡、降低養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化、減少病菌滋生和增強水生動物免疫力的效果[22]。Thimmalapura, et al.[23]向蝦池中投入了以芽孢桿菌為主的復合微生物制劑, 試驗結(jié)果表明, 加入益生菌增加了水體沉積物好養(yǎng)菌的數(shù)量, 抑制了有害弧菌的數(shù)量, 加速了水體中有機物的降解過程, 提高了對蝦的產(chǎn)量。李卓佳等[24]分析比較施用芽孢桿菌制劑的蝦池和沒有施用任何有益菌的蝦池在養(yǎng)殖后期不同空間的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明, 施用了芽孢桿菌的蝦池芽孢桿菌在蝦池表泥和底泥形成可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌屬, 表泥和底泥總異養(yǎng)細菌數(shù)量增加而水體總異養(yǎng)細菌數(shù)量降低, 水體Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)以及底泥 McIntosh指數(shù)顯著升高。 熊暉等[25]研究發(fā)現(xiàn), 投加光合細菌后, 使得水體中微生物種類達到了自然條件下的2.5倍, 明顯增加了種類豐富度,同時加入光合細菌能明顯提高水體中微生物的多樣性, 且具有持續(xù)性。林亮等[26]對施用芽孢桿菌制劑后蝦池底泥細菌群落的變化進行了研究, 利用Shannon-Wiener 指數(shù)進行生物多樣性分析, 發(fā)現(xiàn)試驗池和對照池底泥細菌的多樣性指數(shù)、豐度和均勻度在整個養(yǎng)殖過程的動態(tài)變相似, 前期較低, 中期、后期和末期都有不同程度的升高。

本研究結(jié)果表明, 在添加益生菌后, 水體菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。林亮等[26]對施用芽孢桿菌制劑后蝦池底泥細菌群落的變化進行了研究。結(jié)果表明, 芽孢桿菌制劑改變了蝦池底泥細菌類群組成, 增加了底泥好氧細菌的數(shù)量; 與對照池相比, 試驗池的優(yōu)勢菌屬發(fā)生了變化黃桿菌屬 (Flavobacterium)和黏纖維菌屬 (Cytophaga)數(shù)量增加, 而弧菌 (Vibrio)和發(fā)光細菌(Photobacterium)數(shù)量相對減少, 且對蝦的成活率、體重和產(chǎn)量提高。趙亮等[27]發(fā)現(xiàn), 在人工半咸水河蟹全封閉育苗系統(tǒng)中加入光合細菌, 異養(yǎng)細菌的類群發(fā)生了較大變化, 弧菌數(shù)量下降了11.1%, 氣單胞菌數(shù)量下降了 8.3%, 生物多樣性有增加的趨勢。本研究還發(fā)現(xiàn), 添加益生菌后養(yǎng)殖水體中變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)為優(yōu)勢菌。變形菌屬革蘭陰性細菌, 是原核生物中最大的分支之一[28—30]。據(jù)報道, α- 和 β-變形桿菌和脫氮有關(guān)[31,32]。 放線菌可降解有機化合物, 并參與物質(zhì)循環(huán)[33], 擬桿菌一直是廢水處理系統(tǒng)中的最優(yōu)勢類群[34], 在復雜生物大分子和腐殖質(zhì)降解中發(fā)揮著重要作用[35,36]。放線菌能夠產(chǎn)生種類繁多的抗生素、維生素和酶, 它的生長能改善水體的味道并對水體有消毒作用, 對病原微生物有抑制作用, 特別是能夠抑制腐敗菌的生長繁殖, 轉(zhuǎn)化氮、磷等元素的功能[37], 還起著一些無法定義的生態(tài)作用[38]。由此可見, 在水體中添加益生菌改變菌群結(jié)構(gòu)有益于改善養(yǎng)殖水質(zhì)。

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COMPARATIVE ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITY FROM GRASS CARP CULTURE WATER SUPPLEMENTATION WITH DIFFERENT PROBIOTICS

ZHANG Xiao-Ping1, WANG Yi-Bing1, DENG Bin1, ZHENG Jia-Jia1, HU Cai-Hong1,
WU Xue-Xiang2and LI Wei-Fen1
(1. Institute of Feed Science, College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this study, 454-pyrosequencing technology was employed to investigate the microbial community structure in grass carp culture water with or without different probiotics. The results showed that all three treatments remarkably increased the bacterial diversity compared to the control. In two samples (Control and CB), the dominant phylum was Proteobacteria. However, there was only moderate difference in the content of Proteobacteria and Actinobacteria between sample BS and PSB. Actinobacteria and Bacteroidetes in PSB, BS, and CB were more abundant than those in the control group. The detailed analysis of Proteobacteria showed that in PSB, BS and CB samples, the majority of Proteobacteria consisted of αsubdivision, followed by Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, and Deltaproteobacteria; in the control sample, the dominant subtype was Gammaproteobacteria, followed by Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria, and Deltaproteobacteria. For Bacteroidetes, Flavobacteria was the dominant subtype in treated samples but not in the control sample. At the order level we also oberseved a marked difference between the control and the treatment in terms of the composition of Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Bacteroidetes. The results indicated that the addition of different probiotics into water could increase the diversity and alter the structure of a microbial community.

Probiotic; Grass carp; Microbial community structure; 454- Pyrosequencing

S965.1; Q145+.1

A

1000-3207(2014)03-0459-08

10.7541/2014.65

2013-05-07;

2014-02-12

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃(973)項目(2009CB118705); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203083); 貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)“喀斯特山區(qū)大鯢模擬生境繁育配套技術(shù)研究”項目(黔科合NY字[2010]3053號)資助

張小平(1985—), 男, 湖北棗陽人; 博士研究生; 研究方向為益生菌與健康養(yǎng)殖。E-mail: zhangxiaoping403@gmail.com

李衛(wèi)芬(1965—), E-mail: wfli@zju.edu.cn