高 敏，劉愛蘭，郭存九，喬瑞紅

冠狀動(dòng)脈阻塞相互作用蛋白引起的心肌缺血是缺血性心臟病中重要的致死原因，嚴(yán)重危害人類的健康，深入研究缺血性心臟病的分子機(jī)制，探索新的發(fā)病機(jī)制和治療標(biāo)靶，對缺血性心臟病的臨床治療具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。蛋白激酶C相互作用蛋白（PICK1）廣泛表達(dá)于人和動(dòng)物的各種組織，以大腦和睪丸中表達(dá)最高，肺中最低［1］。PICK1可與多種蛋白相互作用從而發(fā)揮多項(xiàng)生物學(xué)功能，現(xiàn)有的研究表明，PICK1與疼痛、腦卒中、精神分裂癥及腫瘤等疾病相關(guān)［2-5］，其關(guān)鍵性作用使其成為上述疾病治療的潛在靶點(diǎn)，而PICK1在心肌梗死方面的研究鮮見報(bào)道，本研究旨在觀察PICK1在心肌梗死動(dòng)物血清及心肌組織中的表達(dá)情況，探討其在心肌梗死發(fā)生中的可能作用，為心肌梗死的研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量200 g～230 g。飼養(yǎng)條件：溫度23℃，濕度95%，12 h明暗交替，大鼠專用飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守倫理學(xué)準(zhǔn)則。

1.2 心肌梗死動(dòng)物模型制備 將43只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：急性心肌梗死模型組20只，假手術(shù)組15只，正常對照組8只。心肌梗死模型組參照文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行構(gòu)建，采用1%戊巴比妥鈉（劑量40 mg／kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，取仰位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)備皮消毒后，自胸骨左緣3～4肋間作一2 cm切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，打開心包，暴露心臟，以肺動(dòng)脈圓錐和左心耳連線中點(diǎn)與心尖的連線為標(biāo)志尋找左冠狀動(dòng)脈前降支，0號(hào)線結(jié)扎，結(jié)扎部位以下心肌顏色變暗，搏動(dòng)減弱，心電顯示ST段弓背抬高表明造模成功，將心臟還入胸腔，逐層縫合；假手術(shù)組僅于左冠狀動(dòng)脈前降支穿線，不做結(jié)扎，其余手術(shù)過程同模型組。

1.3 ELISA檢測大鼠外周血PICK1的表達(dá)水平 分別于手術(shù)后1 d、3 d、7 d采集各組大鼠尾靜脈血1 m L，室溫自然凝固10 min，離心（10 min，3 000 r／min）取上清液，-70℃冰箱保存。ELISA檢測步驟按照試劑說明書進(jìn)行。

1.4 免疫印跡檢測心肌組織PICK1的表達(dá)水平 分別于手術(shù)后1 d、3 d、7 d分批采用頸椎脫臼猝死大鼠，常規(guī)皮膚消毒，打開胸腔。稱取心肌組織各0.1 g，眼科剪剪碎，加入組織裂解液，低溫離心去上清（4℃，12 000 r／min，8 min），紫外分光光度計(jì)上測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白含量。制備SDS-聚丙烯酰胺分離膠（8%）和濃縮膠（5%），分子量Marker及蛋白樣本各上樣20μL，電泳槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，60 V預(yù)電泳40 min，100 V電泳50 min。濕轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC）上，轉(zhuǎn)膜條件：電壓110 V，電流350 m A，時(shí)間30 min。蛋白干粉（上海生工）室溫封閉1 h，按照說明書參考濃度稀釋一抗（PICK1 1∶1 000；GAPDH 1∶500），將NC膜置于其中，4℃冰箱過夜反應(yīng)，TBST（含吐溫20）緩沖液洗膜3次后置于二抗（1∶3 000）中室溫輕搖反應(yīng)30 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像儀曝光顯色。Bandscan圖像分析軟件對顯影條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參的比值作為蛋白的相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清PICK1的表達(dá)水平 20只心肌梗死模型組大鼠最終18只模型構(gòu)建成功（2只大鼠實(shí)驗(yàn)過程中死亡，成功率90%），假手術(shù)組無大鼠死亡。與正常對照組及假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠建模后1 d血清PICK1水平略有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；自3 d開始，心肌梗死模型組大鼠血清PICK1的水平明顯高于假手術(shù)組及正常對照組（P＜0.05）；7 d時(shí)，心肌梗死模型組血清PICK1高于假手術(shù)組及正常對照組（P＜0.05），但與3 d時(shí)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠血清PICK1的表達(dá)水平（x±s） ng／L

2.2 各組大鼠心肌組織PICK1的表達(dá)水平 與正常對照組及假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠建模后1 d、3 d、7 d時(shí)心肌組織PICK1蛋白的水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組各時(shí)間點(diǎn)PICK1蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組與正常對照組PICK1蛋白的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織PICK1的表達(dá)水平

3 討 論

PICK1是Staudinger等分離到的一個(gè)蛋白質(zhì)，在人類、大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物中PICK1氨基酸序列同源性在90%以上，單體分子量均在50 kDa左右［7］。該蛋白具有較為特殊的PDZ結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域，除了和PKCα相互作用外，還能與細(xì)胞內(nèi)不同受體有相互作用，諸如谷氨酸AMPA受體的GluR2和Glu R3亞基、代謝型谷氨酸受體mGluR7a、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）、酸性敏感性通道受體（ASIC）等［8，9］。據(jù)報(bào)道，PICK1不僅參與記憶，外周神經(jīng)感覺，神經(jīng)介質(zhì)傳遞與調(diào)節(jié)，細(xì)胞的生長和黏合過程等生理學(xué)過程，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病中發(fā)揮一定的作用，由于PICK1與絕大多數(shù)配體蛋白的相互作用是通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與配體C末端區(qū)域的結(jié)合介導(dǎo)的，使PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域成為一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。

最近，PICK1在缺血性中樞神經(jīng)疾病方面的研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，Yu等［10］研究表明，在腦缺血再灌注損傷的過程中，PICK1表達(dá)顯著上調(diào)，功能性敲除PICK1基因的對缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。Dixon等［11］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧氣和葡萄糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）引起的AMPA受體亞單位轉(zhuǎn)換依賴于PICK1蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域，而且這種亞單位轉(zhuǎn)換與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡有關(guān)。

本研究通過經(jīng)典的冠脈左前降支結(jié)扎法構(gòu)建心肌梗死動(dòng)物模型，對不同組別大鼠血清PICK1分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后24 h外周血PICK1表達(dá)無顯著變化，而在建模后的3 d時(shí)PICK1的表達(dá)顯著增高，7 d時(shí)雖略有回落，但仍高于假手術(shù)組及正常對照組。與外周PICK1表達(dá)模式不同的是，心肌梗死早期心肌組織PICK1已明顯上調(diào)，并且以基本相同的水平維持至實(shí)驗(yàn)7 d，上述研究結(jié)果表明，PICK1可能參與了心肌梗死缺血再灌注損傷的病理過程，外周血PICK1的滯后上調(diào)反應(yīng)可能與心肌細(xì)胞損傷后釋放有關(guān)。值得注意的是，本研究假手術(shù)組血清及心肌組織PICK1雖與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均略有增高，提示PICK1還可能與創(chuàng)傷及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，PICK1作為一種功能多樣的蛋白質(zhì)，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮一定的作用，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。鑒于PICK1結(jié)構(gòu)的特殊性，利用相互作用抑制劑特異性的調(diào)節(jié)，甚至阻斷PICK1的功能，有望為缺血性心肌病的治療帶來新的曙光。

［1］ Staudinger J，Zhou J，Burgess R，et al.PICK1：A perinuclear binding protein and substrate for protein kinase C isolated by the yeast two-hybrid system［J］.J Cell Biol，1995，128（3）：263-271.

［2］ Garry EM，Moss A，Rosie R，et al.Specific involvement in neuropathic pain of AMPA receptors and adapter proteins for the GluR2 subunit［J］.Mol Cell Neurosci，2003，24：10-22.

［3］ Opitzt，Grrooms SY，Bennett MV，et al.Remodeling of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid subunit composition in hippocampal after global ischemia［J］.Proc Natl USA，2000，97：13360-13365.

［4］ Hong CJ，Liao DL，Shih HL，et al.Association study of PICK1 rs3952 polymorphism and schizophrenia［J］.Neurorepert，2004，15（12）：1965-1967.

［5］ Lin WJ，Chang YF，Wang WL，et al.Mitogan-stimulated TIS21 protein interacts with a protein-kinase-Calpha-binding protein rPICKl［J］.Biochem J，2001，354（Pt 3）：635-643.

［6］ Campbell DJ，Kladis A，Valentijn AJ.Effects of losartan on angiotenainand bradykinin peptides and ongiotemin-converting enzyme［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1995，26（2）：233-240.

［7］ Takeya R，Takeshige K，Sumimoto H.Interaction of the PDZ domain of human PICK1 with class I ADP ribosylation factors［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，267：149-155.

［8］ Boudin H，Craig AM.Molecular determinants for PICK1 synaptic aggregation and mGluR7a receptor coclustering：Role of the PDZ，coiled-coil，and acidic domains［J］.J Biol Chem，2001，276（32）：30270-30276.

［9］ Hruska-Hageman AM，Wemmie JA，Price MP，et al.Interaction of the synaptic protein PICK1（protein interacting with C kinase 1）with the non-voltage gated sodium channels BNC1（brain Na＋channel 1）and ASIC（acid-sensing ion channel）［J］.Biochem J，2002，361（Pt3）：443-450.

［10］ Yu DF，Wu PF，F(xiàn)u H，et al.Aging-related alterations in the expression and distribution of GluR2 and PICK1 in the rat hippocampus［J］.Neurosci Lett，2011，497（1）：42-45.

［11］ Dixon RM，Mellor JR，Hanley JG.PICK1-mediated glutamate receptor subunit 2（GluR2）trafficking contributes to cell death inoxygen／glucose-deprived hippocampal neurons［J］.J Biol Chem，2009，284：14230-14235.