梁 棟，梁 鋼，劉云峰，楊 靜

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以肝細(xì)胞脂肪變性為主，與酒精性肝病類似而無過量飲酒史的臨床病理綜合征。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者由于肥胖、高脂血癥等因素，因而更易發(fā)生NAFLD［1］。黃芪為中藥益氣藥，有補(bǔ)益脾肺，益氣補(bǔ)陽之功效，已廣泛用于臨床。據(jù)報(bào)道，黃芪可使高脂血癥小鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）水平降低，還具有抗脂質(zhì)過氧化、抗氧自由基等作用［2，3］。本研究旨在觀察黃芪注射液對糖尿病合并NAFLD大鼠血糖、血脂、肝臟形態(tài)學(xué)變化及脂肪分化相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 雄性清潔級Wistar大鼠48只，體質(zhì)量180 g～200 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會審查通過。將Wistar大鼠隨機(jī)選擇16只作為正常對照組，喂以普通飼料，其余30只用于制備糖尿病非酒精性脂肪肝模型，飼養(yǎng)環(huán)境控制在22℃～25℃。造模方法：高糖高脂飼料飼養(yǎng)（普通飼料66.5%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鹽1%）。飼養(yǎng)4周后以50 mg／kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周?？崭刮察o脈采血測空腹血糖（FBG），以3次FBG＞11.1 mmol／L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。將32只造模成功大鼠隨機(jī)選擇16只作為干預(yù)組，余16只作為模型組。干預(yù)組大鼠每日給予黃芪注射液3 mL／kg腹腔注射，對照組及模型組給予同體積生理鹽水。

1.2 標(biāo)本采集及檢測 于干預(yù)后4周、8周（實(shí)驗(yàn)12周、16周）分批頸椎脫臼處死大鼠，心臟采血6 m L～8 m L，放于消毒干燥的EP管中，待血液凝固后1 000 r／min離心15 min，分離血清，-20℃保存待檢。取大鼠肝臟右葉中部標(biāo)本，一份置于-80℃冰箱保存，一份置于10%甲醛溶液中固定。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法。血TG、TC采用全自動生化分析儀檢測，試劑盒購自北京中杉試劑公司。

1.3 肝臟HE染色標(biāo)本制備 梯度濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為3μm切片，行蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片。

1.4 免疫印跡檢測肝臟ADRP的表達(dá)水平 稱取肝臟組織各0.1 g，按1∶1比例加入組織裂解液，4℃離心機(jī)，10 000 r／min，離心10 min，取上清，紫外分光光度計(jì)上測OD值，計(jì)算蛋白含量。配制8%和5%SDS-聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，電泳槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，60 V預(yù)電泳40 min，100 V電泳1 h。濕轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，設(shè)定參數(shù)100 V、350 m A轉(zhuǎn)膜3 0 min。蛋白干粉封閉，按照1∶1 0 0 0濃度稀釋ADRP一抗（santa cruz，sc-32888），將膜置于其中，4℃冰箱過夜，TBST緩沖液洗膜3次后置于二抗中室溫輕搖反應(yīng)1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像儀曝光顯色。Bandscan圖像分析軟件對顯影條帶進(jìn)行灰度分析，以平均灰度值作為蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖及血脂的變化 8周時，模型組及干預(yù)組大鼠血糖、血TG及TC水平顯著高于對照組（P＜0.05）；12周時，干預(yù)組大鼠血糖、血TG及TC水平略低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；16周時，干預(yù)組大鼠血糖及TG水平明顯低于模型組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠血糖、血TG及TC水平比較±s） mmol／L

表1 各組大鼠血糖、血TG及TC水平比較±s） mmol／L

組別 血糖TG TC對照組 實(shí)驗(yàn)前5.33±0.17 0.79±0.20 1.53±0.26 8周 5.39±0.45 0.82±0.16 1.47±0.15 12周 5.26±0.31 0.80±0.27 1.60±0.22 16周 5.42±0.48 0.86±0.19 1.81±0.34模型組 實(shí)驗(yàn)前 5.29±0.62 0.84±0.27 1.49±0.31 8周 12.97±3.241） 1.35±0.461） 2.35±0.601）12周 16.08±2.421） 1.96±0.531） 3.26±0.721）16周 21.15±4.971） 2.86±0.491） 4.03±0.551）干預(yù)組 實(shí)驗(yàn)前 5.38±0.55 0.81±0.31 1.45±0.27 8周 14.02±4.511） 1.42±0.381） 2.57±0.521）12周 15.82±3.041） 1.79±0.471） 3.04±0.391）16周 17.47±3.171）2） 1.95±0.541）2） 3.18±0.641）與對照組同一時間相比，1）P＜0.05；與模型組同一時間相比，2）P＜0.05

2.2 各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化 正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻一致，肝索及肝竇排列整齊。實(shí)驗(yàn)12周、16周時，模型組大鼠肝臟發(fā)生不同程度的脂肪變性，光鏡下表現(xiàn)為肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的空泡（脂滴），細(xì)胞核偏向細(xì)胞的一側(cè)，中央靜脈，匯管區(qū)及肝竇可見大量炎細(xì)胞浸潤。干預(yù)組大鼠12周時肝臟脂肪變性程度與模型組大鼠基本相當(dāng)，而炎細(xì)胞浸潤程度較模型組程度輕。至實(shí)驗(yàn)16周時，干預(yù)組大鼠肝脂肪變性程度明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤基本消失。

2.3 不同組別大鼠肝臟ADRP的表達(dá)水平 與對照組相比，模型組大鼠肝臟ADRP的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12周、16周時，干預(yù)組大鼠肝臟ADRP的表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 ADRP在大鼠肝臟中的表達(dá)

3 討 論

糖尿病是目前威脅人類健康的主要慢性病之一。糖尿病患者由于長期的高血糖，會出現(xiàn)多種并發(fā)癥，其中非酒精性脂肪肝較為常見。就機(jī)制而言，由于胰島素抵抗促進(jìn)外周脂肪分解和高胰島素血癥使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，另一方面，氧化應(yīng)激引起肝細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，甚至發(fā)生壞死和纖維化［4］，目前臨床治療NAFLD主要以改善胰島素抵抗，降低肝臟非酯化脂肪酸水平，改善氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，糾正促纖維化、促炎因子與抗纖維化、抗炎因子之間的失衡為主。二甲雙胍、他汀類及貝特類藥物雖然可以從不同角度改善肝臟的病變程度［5-7］，但副反應(yīng)也較為明顯，例如：二甲雙胍具有一定的心臟毒性和骨折風(fēng)險。黃芪是我國傳統(tǒng)中藥較常用的一種，且黃芪具有毒副反應(yīng)小的特點(diǎn)，有研究報(bào)道黃芪對預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展具有重要作用。

本研究首先采用高糖高脂飼料和鏈脲佐菌素建立糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠模型，通過對模型組大鼠血糖、TG和TC的檢測發(fā)現(xiàn)，模型存在明顯的脂代謝紊亂，肝臟病理切片證實(shí)脂肪變性發(fā)生，表明糖尿病NAFLD模型構(gòu)建成功。經(jīng)過4周黃芪注射液的治療，至實(shí)驗(yàn)12周時，干預(yù)組大鼠血清血糖、TG和TC水平均低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟病理學(xué)切片檢查顯示，干預(yù)組大鼠12周時肝臟脂肪變性程度與模型組大鼠基本相當(dāng)，而炎細(xì)胞浸潤程度較模型組程度輕。至16周時，干預(yù)組大鼠血清血糖及TG水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且干預(yù)組大鼠肝脂肪變性程度明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤基本消失，提示黃芪注射液早期通過減輕炎癥反應(yīng)對NAFLD大鼠肝臟起到一定的保護(hù)作用，并且隨著治療的進(jìn)行，可延緩肝臟的脂肪變性進(jìn)程。

脂肪分化相關(guān)蛋白是一種脂滴表面蛋白，在幾乎所有類型的哺乳類培養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)；在機(jī)體內(nèi)ADRP表達(dá)于脂肪組織、肝臟、肌肉、乳腺、胰腺、小腸黏膜等，在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝、非酒精性脂肪肝以及酒精性脂肪肝內(nèi)ADRP蛋白亦顯著增加［8，9］，研究表明能夠誘導(dǎo)肝內(nèi)TG增加的刺激均可增加肝細(xì)胞內(nèi)ADRP蛋白的表達(dá)，且ADRP含量與肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量呈正相關(guān)，所以ADRP被認(rèn)為是肝臟脂質(zhì)蓄積的標(biāo)記物［10］。本研究通過Western-blot檢測了大鼠肝臟ADRP蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，NAFLD大鼠肝臟ADRP水平顯著增高，經(jīng)黃芪注射液治療后，NAFLD模型肝臟ADRP的表達(dá)水平下調(diào)，說明黃芪注射液可減少肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，減輕脂肪變性程度。

綜上所述，黃芪注射液可改善NAFLD大鼠血糖血脂代謝紊亂，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)和變性，具有一定的肝臟保護(hù)作用。而其發(fā)揮作用的具體機(jī)制以及對人NAFLD的療效尚待進(jìn)一步研究。

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