賈蘭虹，張雪巖，劉麗艷，李希才，孫曉丹

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；3.葦河林業(yè)局青山林木種子園，黑龍江 尚志 150628； 4.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

我國(guó)是獼猴桃資源大國(guó)，全世界獼猴桃屬植物共有54個(gè)種, 21個(gè)變種, 75個(gè)分類群，我國(guó)就分布52個(gè)種，73個(gè)分類群[1]。在黑龍江省境內(nèi)有3個(gè)種，分別是軟棗獼猴桃[Actinidia arguta(Siebold & Zucc.) Planch. ex Miq.]、狗棗獼猴桃[A.kolomikta(Maxim. & Rupr.) Maxim.]和葛棗獼猴桃[A.polygama(Siebold & Zucc.) Maxim.]，生長(zhǎng)在張廣才嶺、老爺嶺、完達(dá)山、小興安嶺和長(zhǎng)白山脈。三種野生獼猴桃是珍貴的爬藤野生果樹(shù)，野生果是可直接食用的山珍，味美香甜，天然維生素C、多酚、總黃酮及微量元素Mn、Fe等含量均高于美味獼猴桃[2-3]，并富含蛋白質(zhì)、糖、果酸、淀粉和果膠等[4]。隨著生態(tài)旅游發(fā)展，人們涌向林區(qū)，品食野味興趣變得強(qiáng)烈。為保護(hù)自然居群雌株數(shù)量和天然雜交育種體系完整性不被破壞，必須盡快建立起保護(hù)利用技術(shù)體系和預(yù)警機(jī)制，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)資源消長(zhǎng)，鑒定評(píng)價(jià)野生獼猴桃優(yōu)異性狀，建立種質(zhì)庫(kù)，大規(guī)模選種栽培，減輕野生資源的壓力。

1 RAPD分子標(biāo)記[5]

2011-2012年分別對(duì)來(lái)自黑龍江省境內(nèi)野生獼猴桃7個(gè)主要居集地的軟棗6個(gè)居群48份；狗棗6個(gè)居群66份；葛棗1個(gè)居群2份，共計(jì)116份材料進(jìn)行RAPD標(biāo)記分析。48份軟棗中，賓縣4份，五常12份，海林2份，葦河16份，平山7份，牡丹江5份；66份狗棗中，牡丹江5份、伊春33份、賓縣1份，五常7份，平山16份，海林4份，只有五?？刹杉礁饤梼H2份。三種獼猴桃可在同一地采集到的只有五常，而伊春、牡丹江牡丹峰只有狗棗，葦河只有軟棗。見(jiàn)表1。

表1 野生獼猴桃種質(zhì)資源采集

RAPD反應(yīng)體系用30個(gè)引物對(duì)116個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，只有1個(gè)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，29個(gè)引物(96.7%)擴(kuò)增了全部樣本，其中12個(gè)引物擴(kuò)增了93.4%樣本。結(jié)果顯示，不同來(lái)源的居群有著豐富的DNA譜帶，以軟棗為例，基因型豐富(圖1，圖2，圖3)。從植株形態(tài)和收集到的果實(shí)變異類型也證實(shí)了這一點(diǎn)。

1賓縣，2葦河，3五常，4哈爾濱，5牡丹江，6海林

1賓縣，2葦河，3五常，4哈爾濱，5牡丹江，6海林

1賓縣，2葦河，3五常，4哈爾濱，5牡丹江，6海林

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究[6]

對(duì)采集的果實(shí)進(jìn)行可溶性固形物含量、果實(shí)硬度、重量的貯藏變化測(cè)定。參照王清等方法[6]提取軟棗獼猴桃果實(shí)蛋白質(zhì)。用2D-Quant試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，等電聚焦電泳和SDS-PAGE分離，并在果實(shí)后熟生理學(xué)的關(guān)鍵拐點(diǎn)進(jìn)行與后熟相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以明確蛋白差異表達(dá)與重要生理過(guò)程如乙烯的自我調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)、果實(shí)軟化機(jī)理、呼吸代謝和膜脂過(guò)氧化等關(guān)鍵蛋白的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)已成為研究果實(shí)成熟衰老過(guò)程中蛋白差異表達(dá)的主要技術(shù)方法, 已應(yīng)用于番茄、桃、葡萄、柑橘、草莓、蘋(píng)果等果實(shí)成熟衰老的分子機(jī)理研究[8]。對(duì)軟棗獼猴桃果實(shí)成熟過(guò)程及采后后熟蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚無(wú)報(bào)道。軟棗獼猴桃果實(shí)采收后，最大的問(wèn)題就是貯藏時(shí)間短，常溫下放置2～5 d，果實(shí)軟化。4 ℃時(shí)可貯20～25 d。采收時(shí)期，采后溫度等均影響果實(shí)生理硬度。試驗(yàn)在軟棗獼猴桃果實(shí)采后后熟生理學(xué)的拐點(diǎn)即，可溶固形物開(kāi)始升高(圖4)、果實(shí)硬度開(kāi)始下降時(shí)(圖5)，對(duì)果皮，果肉進(jìn)行蛋白質(zhì)全息制備。通過(guò)等點(diǎn)聚焦(IEF)及聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)雙向電泳技術(shù)，得到各階段蛋白質(zhì)組圖像，總蛋白的2-DE分離集中在pH4～7范圍內(nèi)，樣品經(jīng)銀染后得到476個(gè)蛋白點(diǎn)，并且可以看出蛋白在等電點(diǎn)和分子量2個(gè)方向都得到了較好的分離。圖6。

圖4 軟棗采后4 ℃貯藏可溶性固形物含量升高曲線

圖5 軟棗4 ℃貯藏果重下降曲線

差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜定量分析，發(fā)現(xiàn)果實(shí)36 個(gè)蛋白差異表達(dá)有明顯變化(Ratio≥1.2)，這些蛋白分別參與了基礎(chǔ)代謝、次級(jí)代謝、乙烯合成以及溫度脅迫反應(yīng), 其中ACC氧化酶變化最為顯著。根據(jù)蛋白點(diǎn)信息的數(shù)目、大小、強(qiáng)弱，檢測(cè)、鑒定和統(tǒng)計(jì)分析，為下一步確定拐點(diǎn)關(guān)鍵酶種類及含量打下基礎(chǔ)。

圖6 軟棗獼猴桃果實(shí)蛋白質(zhì)300 μg 樣品2-DE 圖譜

3 野生獼猴桃原生境保護(hù)，資源狀況動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

黑龍江省是農(nóng)林大省，森林是國(guó)家生態(tài)環(huán)境建設(shè)和保護(hù)的重點(diǎn)區(qū)域， 已建設(shè)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)24個(gè)，省部級(jí)自然保護(hù)區(qū)7個(gè)，生物多樣性得到加強(qiáng)。40個(gè)林業(yè)局分別位于黑龍江省中部、北部和東南部的小興安嶺、張廣才嶺、老爺嶺和完達(dá)山林區(qū)，3種獼猴桃分布其中。一些珍貴樹(shù)種和動(dòng)物被列為國(guó)家和省級(jí)保護(hù)對(duì)象。從保護(hù)森林生態(tài)環(huán)境出發(fā)應(yīng)用了地理信息管理系統(tǒng)[9]但很多具有重要科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生資源并未列入國(guó)家或省級(jí)保護(hù)種類中，個(gè)體數(shù)量處于漸危或?yàn)l危狀態(tài)。野生獼猴桃屬植物整體受?chē)?guó)家保護(hù)，但獼猴桃是雌雄分株植物，以居群或個(gè)體在自然界中存在，最有絕跡的危險(xiǎn)。軟棗獼猴桃為漸危植物，葛棗獼猴桃為稀有植物[10]。2011-2012年在黑龍江省境內(nèi)野生獼猴桃7個(gè)主要居集地對(duì)133株進(jìn)行了GPS定位，對(duì)其中116株進(jìn)行了基因型分析，并建立起資源庫(kù)，將分子標(biāo)記成果并入國(guó)家數(shù)據(jù)庫(kù)，依靠國(guó)家基礎(chǔ)研究實(shí)力，建立優(yōu)異基因發(fā)掘利用的技術(shù)體系。把自然生境的野生獼猴桃列入省重點(diǎn)保護(hù)野生植物資源調(diào)查和小種群野生植物拯救保護(hù)工程規(guī)劃，并建立起預(yù)警機(jī)制。

4 野生獼猴桃種質(zhì)異位保護(hù)研究

野生獼猴桃一直被認(rèn)為是有開(kāi)發(fā)前景的漿果之一。1981年黑龍江省農(nóng)科院園藝分院開(kāi)始進(jìn)行寒地野生果樹(shù)資源收集工作，其中包含3種獼猴桃。2000年在黑龍江省葦河林業(yè)局青山林木種子園建成野生軟棗獼猴桃異位園收集了662種優(yōu)株，占用山地11 000 m2，以茶條槭作伴生樹(shù)[11]，保持著半野生狀態(tài)，經(jīng)分子標(biāo)記分析，基因型豐富，多態(tài)性高，已成為珍貴的軟棗獼猴桃基因庫(kù)(圖1、圖2、圖3)。對(duì)來(lái)自賓縣、五常、海林、哈爾濱和牡丹江的野生獼猴桃，經(jīng)分子標(biāo)證實(shí)也是珍貴的基因資源。將這些材料植入獼猴桃種質(zhì)圃形成圃位-原位-異位三重形式保護(hù)資源，作為目標(biāo)種質(zhì)進(jìn)一步研究。

5 天然雜交分離群體構(gòu)建研究

獼猴桃是雌雄異株植物，育種改良至今存在優(yōu)異父本選擇的難度問(wèn)題。通常把在天然群體中優(yōu)選作為便捷的育種途徑。但是，自然優(yōu)株實(shí)屬稀有，在當(dāng)今開(kāi)放的山林中更是罕見(jiàn)，人工選育親本雜交育種方法不能不成為今后的育種方向。掌握獼猴桃的遺傳規(guī)律培育新品種，雖然要花費(fèi)幾十年時(shí)間，但確是可永久保持資源大國(guó)的地位，掌握更多次生資源。本文采用經(jīng)過(guò)較嚴(yán)格篩選的10個(gè)來(lái)自野外天然雜交的不同果型變異，以單個(gè)果實(shí)的種子，獲得了9個(gè)實(shí)生分離群體，群體數(shù)量為55～113株。確定了以常規(guī)育種方法選出雌雄優(yōu)株材料，結(jié)合分子育種培育新品種的方向。

6 居群恢復(fù)與保育

黑龍江省林業(yè)在山林撫育管理中，一度偏向保護(hù)用材樹(shù)種，把藤本植物當(dāng)作影響用材樹(shù)種生長(zhǎng)的非目的樹(shù)種清掉，是野生獼猴桃居群種數(shù)減少主要原因。此外，各林區(qū)開(kāi)發(fā)了旅游產(chǎn)業(yè)，野生果樹(shù)資源遭到破壞。從野生資源調(diào)查中看到，在靠近公路網(wǎng)的山林和近山中野生獼猴桃蹤跡消失，山林中雌雄株比例明顯失調(diào)。雌株數(shù)量消減，已危及種群的存在。天然基因庫(kù)遺傳多樣性下降，意味著資源枯竭。所以，在資源發(fā)掘同時(shí)，建苗圃繁育苗木，進(jìn)行資源補(bǔ)充和保育，嘗試在原位進(jìn)行種群增加和恢復(fù)。

7 討 論

黑龍江省野生獼猴桃資源調(diào)查研究斷斷續(xù)續(xù)已有40多年的歷史，研究基礎(chǔ)依然薄弱，近年來(lái)，雖然已明確這3種資源基因型豐富，具有遺傳多樣性，但，至今仍沒(méi)有得到真正意義上的保護(hù)利用，主要原因是選育品種技術(shù)復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，開(kāi)展人工雜交存在父本優(yōu)選難，雜種苗雌雄鑒別尚無(wú)有效技術(shù)手段[12]，靠常規(guī)育種要花費(fèi)幾十年乃至上百年時(shí)間，如日本和新西蘭。在我國(guó)，傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法盡管樸實(shí)可靠，但仍存在極大盲目和風(fēng)險(xiǎn)性，幾乎沒(méi)有人駐足這一領(lǐng)域。隨著科技進(jìn)步和各種研究平臺(tái)的搭建，已認(rèn)識(shí)到僅從發(fā)現(xiàn)挖掘現(xiàn)有優(yōu)良野生資源進(jìn)行栽培，并不能增加資源財(cái)富，對(duì)遺傳規(guī)律也無(wú)從知曉，只有從分子生物學(xué)入手，構(gòu)建寒地野生獼猴桃基因庫(kù)，和通過(guò)開(kāi)展與國(guó)內(nèi)外科技合作，采取分子育種與常規(guī)育種結(jié)合方式，才能解決難題，普及人工栽培，使這一物種資源得到科學(xué)地持續(xù)發(fā)掘利用。

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