李雙梅，柯衛(wèi)東，彭靜，李峰，鐘蘭，孫亞林

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065）

菱花粉生活力測(cè)定方法研究

李雙梅，柯衛(wèi)東，彭靜，李峰，鐘蘭，孫亞林

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065）

為了探索菱花粉生活力的最佳測(cè)定方法，以孝感紅菱花粉為試材，利用無機(jī)鹽培養(yǎng)法、MTT（四甲基噻唑藍(lán)）染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法對(duì)花粉生活力進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加低濃度的蔗糖和硼酸對(duì)菱花粉的萌發(fā)有促進(jìn)作用，菱花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%；用MTT染色法和TTC染色法測(cè)定菱花粉生活力，染色率僅為36.9%和27.1%，效果不理想。

菱；花粉；生活力；萌發(fā)率

菱（Trapa spp.），別名菱角、龍角、水粟等，為菱科菱屬一年生水生草本植物，起源于歐洲和亞洲的溫暖地區(qū)[1]，中國(guó)是菱的原產(chǎn)地之一[2]。菱在中國(guó)的分布范圍較廣，中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南各省、自治區(qū)均有栽培。

研究菱花粉生活力對(duì)雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者在菱的分類[3]、形態(tài)學(xué)[4]、細(xì)胞學(xué)[5]、生理生化[6]、栽培技術(shù)[7]等方面做了大量工作，在菱屬植物傳粉生物學(xué)方面也有少量研究[8]，而有關(guān)適宜菱花粉生活力測(cè)定方法的研究卻未見報(bào)道。花粉生活力測(cè)定的方法很多，主要有顯微鏡形態(tài)觀測(cè)法、染色法、培養(yǎng)基發(fā)芽法等[9]。本文采用無機(jī)鹽培養(yǎng)法、MTT染色法和TTC染色法對(duì)孝感紅菱花粉生活力進(jìn)行測(cè)定，以期找到菱花粉生活力測(cè)定的最佳方法，為菱的雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2012年8月在國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃采集孝感紅菱萼片剛開裂的花蕾。剝?nèi)』ㄋ?，放入培養(yǎng)皿中，置于（25±1）℃的電熱恒溫箱中培養(yǎng)4～5 h，收集花粉備用[10]。

1.2 花粉生活力的測(cè)定方法

①無機(jī)鹽培養(yǎng)法 無機(jī)鹽基液的配制參照胡適宜[11]的方法。取硼酸（H3BO3）0.1 g、硝酸鈣（Ca（NO3）2·4H2O）0.3 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.1 g、硝酸鉀（KNO3）0.1 g，配制成100 mL無機(jī)鹽基液。設(shè)5%、10%、15%、20%、25%、30%6種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖和0、0.005%、0.01%、0.015%4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硼酸的完全隨機(jī)試驗(yàn)，共24個(gè)處理，A，5%蔗糖；B，5%蔗糖+0.005%硼酸；C，5%蔗糖+0.01%硼酸；D，5%蔗糖+0.015%硼酸；E，10%蔗糖；F，10%蔗糖+ 0.005%硼酸；G，10%蔗糖+0.01%硼酸；H，10%蔗糖+0.015%硼酸；I，15%蔗糖；J，15%蔗糖+0.005%硼酸；K，15%蔗糖+0.01%硼酸；L，15%蔗糖+0.015%硼酸；M，20%蔗糖；N，20%蔗糖+0.005%硼酸；O，20%蔗糖+0.01%硼酸；P，20%蔗糖+0.015%硼酸；Q，25%蔗糖；R，25%蔗糖+0.005%硼酸；S，25%蔗糖+0.01%硼酸；T，25%蔗糖+0.015%硼酸；U，30%蔗糖；V，30%蔗糖+0.005%硼酸；W，30%蔗糖+0.01%硼酸；X，30%蔗糖+0.015%硼酸。取少量菱花粉于載玻片上，分別加1～2滴上述培養(yǎng)液，將制備好的片子放在墊有二層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于（25±1）℃條件下培養(yǎng)，3～4 h后觀察花粉萌發(fā)率。

②MTT染色法 MTT溶液配制參照張研等[12]的方法。稱0.5 g MTT于燒杯，溶解于5%蔗糖溶液25 mL中，后裝入棕色試劑瓶，置于冰箱中避光保存。取少量菱花粉于載玻片上，加1～2滴配制好的MTT溶液，蓋上蓋玻片，在室溫下放置10 min，然后在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察。染成紫色的花粉生活力強(qiáng)，染成淡紅色的生活力次之，不能染色的是沒有生活力的花粉或不育花粉。

③TTC染色法 取少量菱花粉放到載玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，攪拌均勻，蓋上蓋玻片，將其在（35±1）℃電熱恒溫箱內(nèi)放置15～20 min。然后在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，被染成紅色的花粉生活力強(qiáng)，被染成淡紅色的花粉生活力次之，不能染色的花粉為失去生活力的花粉或不育花粉。

以上每種方法觀察3個(gè)制片，每個(gè)制片觀察5個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)有生活力花粉粒數(shù)和無生活力花粉粒數(shù)，計(jì)算花粉的活力百分率?；ǚ刍盍Π俜致实挠?jì)算公式為花粉活力百分率（%）=（有活力花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%；花粉萌發(fā)率的計(jì)算公式為花粉萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖、硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

從表1可看出，在無添加硼酸、5%～30%蔗糖濃度下（處理A、E、I、M、Q、U），花粉萌發(fā)率極低，幾乎不發(fā)芽；在0.015%硼酸、5%～30%蔗糖濃度下（處理D、H、L、P、T、X），花粉萌發(fā)率也不高，在2.0%～32.0%；在5%和30%蔗糖濃度下（處理A、B、C、D和處理U、V、W、X），花粉萌發(fā)率也很低，在0～39.4%；以10%蔗糖+0.005%硼酸 （處理F）花粉萌發(fā)率最高，達(dá)65.9%，其次是15%蔗糖+0.005%硼酸（處理J），花粉萌發(fā)率達(dá)57.9%，再次是10%蔗糖+0.01%硼酸（處理G）和20%蔗糖+0.005%硼酸（處理N），花粉萌發(fā)率分別為51.0%和50.5%，表明菱花粉在低濃度蔗糖和低濃度硼酸下萌發(fā)率高。綜合來看，本試驗(yàn)中以10%蔗糖+0.005%硼酸最適合菱花粉萌發(fā)。

2.2 MTT染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察，用MTT染色后，染成紫色和淡紅色（有生活力）的花粉占36.9%，不能染色（沒有生活力）的花粉占63.1%，測(cè)定結(jié)果明顯偏低于無機(jī)鹽培養(yǎng)法最佳培養(yǎng)基測(cè)定菱花粉的萌發(fā)率（65.9%），不能真實(shí)反映菱花粉的生活力。因此，MTT染色法不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用TTC染色后，染成紅色和淡紅色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（沒有生活力）的花粉占72.9%，此方法測(cè)定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基發(fā)芽法是花粉生活力應(yīng)用較廣泛的一種方法，測(cè)定結(jié)果較精確可靠[13]。有研究認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的蔗糖和硼酸利于花粉萌發(fā)。蔗糖不僅為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還維持花粉與培養(yǎng)液之間的滲透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促進(jìn)糖的吸收和代謝，與糖結(jié)合可以提高花粉的萌發(fā)率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果表明，最適宜菱花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%。

測(cè)定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，還有I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法和亞甲基藍(lán)染色法等[9]，不同染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定[9]。本試驗(yàn)中采用MTT法和TTC法測(cè)定菱花粉生活力，染色率均較低，不能真實(shí)反映菱花粉生活力，2種方法均不宜用于測(cè)定菱花粉生活力，同樣也證明了以上觀點(diǎn)。相比較而言，MTT染色法稍接近無機(jī)鹽培養(yǎng)法的測(cè)定結(jié)果，采用不同時(shí)期的菱花粉，選用無機(jī)鹽培養(yǎng)法和MTT染色法進(jìn)行比較測(cè)定，看是否能找到這2種方法在菱花粉生活力測(cè)定上的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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Research on Methods for Pollen Viability Determinationof Water Chestnut

LI Shuangmei,KE Weidong,PENG Jing,LI Feng,ZHONG Lan,SUN Yalin

In order to explore suitable methods for pollen viability determination of water chestnut,the pollen viability of cultivar Xiaoganhongling was determined by using the methods of inorganic salt culture,MTT staining and TTC staining. The results showed that the medium supplemented with low concentrations of sucrose and boric acid could promote the germination of pollen,and the optimum medium for pollen germination was 10%sucrose+0.005%boric acid,with the germination rate of 65.9%.The MTT staining and TTC staining methods were not ideal for pollen viability determination of water chestnut,because their dyeing rates were merely 36.9%and 27.1%.

Water chestnut;Pollen;Viability;Germination rate

S645.4

A

1001-3547（2014）18-0045-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.18.016

武漢市農(nóng)科院創(chuàng)新項(xiàng)目“菱傳粉生物學(xué)及雜交技術(shù)研究”（Cx201408）

李雙梅（1974-），女，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)樗卟朔N質(zhì)資源研究，電話：027-88116313，E-mail：lishm16@163.com

柯衛(wèi)東，男，通信作者，推廣研究員，研究方向?yàn)樗卟朔N質(zhì)資源及育種研究，電話：027-88116313，E-mail：wdke63@163.com

2014-08-11