王 珊， 蔡志龍， 趙 文

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連，116023)

人們最初對(duì)物種進(jìn)行界定時(shí)使用了“形態(tài)種”的概念(morphospecies)，這一概念一直盛行于整個(gè)19世紀(jì)和20世紀(jì)早期。然而，由于有些物種很難用形態(tài)學(xué)來區(qū)分， Mayr[1]首先使用了同胞物種(sibling species)的概念。同胞物種普遍存在于水生無脊椎動(dòng)物中，人們常使用化學(xué)物質(zhì)來鑒定這些相似的物種[2]。對(duì)同胞物種認(rèn)識(shí)的匱乏常常導(dǎo)致生態(tài)調(diào)查者們?cè)陉U述生態(tài)系統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)概念上的混淆，因而對(duì)同胞物種的分類研究十分必要[2-3]。

1 輪蟲分類手段的發(fā)展

輪蟲的主要分類手段之一，是對(duì)輪蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究與觀察。例如，對(duì)褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群(Brachionusplicatiliscomplex)的分類早在20世紀(jì)80年代就已有學(xué)者提出，并依據(jù)輪蟲的被甲背棘刺的形狀特點(diǎn)(尖銳或鈍圓、較寬或狹窄)和被甲腹褶片的形狀特點(diǎn)(傾斜方向、突出物)等將該類群中的一些種類進(jìn)行了初步命名[4]。后來，一些學(xué)者根據(jù)輪蟲背甲的長(zhǎng)、寬及各個(gè)背棘刺的距離等數(shù)量性狀對(duì)復(fù)合類群中的部分輪蟲進(jìn)行了分類和命名[5-6]。但到目前為止，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法仍然是研究和實(shí)際生產(chǎn)中的主要分類方法。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物技術(shù)逐漸成為輪蟲分類主要手段之一。早在20世紀(jì)80年代初就有學(xué)者指出對(duì)輪蟲不同物種及物種復(fù)合體的分類和起源等問題[7]，不少學(xué)者將等位酶技術(shù)應(yīng)用于輪蟲的分類上，盡管各個(gè)研究使用的酶系有所不同，但大多數(shù)的研究結(jié)果都表明，等位酶分析可以用來區(qū)分屬內(nèi)及屬內(nèi)復(fù)合類群的不同物種[8]。Gómez & King[9]建立了一套輪蟲相關(guān)酶的測(cè)試方法，用于鑒別輪蟲品系間的區(qū)別。盡管同工酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于輪蟲的種類鑒定，但是能夠應(yīng)用于種類鑒定的同工酶種類卻十分有限。例如，F(xiàn)u等[10]使用同工酶對(duì)L-型和S-型輪蟲進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在所使用的18種同工酶中只有6種(GPI、LDH、MDH、6PGD、PGM、SOD)表現(xiàn)出了種間差異。然而，在進(jìn)行室外浮游生物種群調(diào)查時(shí)，采集的生物樣本通常為混合樣本，這一情況就會(huì)造成同一譜帶上會(huì)混合各種不同生物的等位酶，影響了分析的結(jié)果。而由于這種方法的局限性，該方法并沒有被普遍接受[11]，因此，將DNA分析引入輪蟲的分類研究就顯得尤為重要，各學(xué)者研究的結(jié)果也表明，同屬輪蟲之間的差異在DNA水平上可以有效地被檢測(cè)出[12-13]。

早期對(duì)輪蟲分類的研究中，提取每個(gè)DNA樣本的輪蟲用量約為2～3 g，這就意味著需要耗費(fèi)大量人力和時(shí)間來培養(yǎng)輪蟲，以達(dá)到樣本需要的量。然而，目前許多種類輪蟲的培養(yǎng)方法還不成熟，很難達(dá)到高密度培養(yǎng)的水平，而且在培養(yǎng)過程中也很難做到單一物種培養(yǎng)，無法保證DNA樣本的用量及純度，因此限制了分子生物學(xué)在輪蟲分類方面研究的發(fā)展。隨著PCR技術(shù)的不斷完善，對(duì)模板DNA的需求量大大降低，輪蟲分類分子水平方面的研究才逐漸發(fā)展起來。2000年，Gómez等[12]用Chelexl00樹脂進(jìn)行單個(gè)褶皺臂尾輪蟲的DNA提取，擴(kuò)增了653 bp輪蟲休眠卵的線粒體COI序列片段，分析了輪蟲種群和休眠卵庫(kù)遺傳結(jié)構(gòu)變化。Leutbecher[14]曾用RAPD分析了3種輪蟲單只個(gè)體的基因組DNA，該分析中需要至少50個(gè)樣本。RAPD-PCR技術(shù)在輪蟲分類方面的運(yùn)用，減少了基因組DNA的需要量，加快了分析速度，也不需要對(duì)目的序列有預(yù)先的了解，推動(dòng)了輪蟲分類的發(fā)展。國(guó)內(nèi)的輪蟲分類研究較晚，董云偉等[15]利用WizardTM基因組DNA純化試劑盒提取了單只輪蟲的DNA，擴(kuò)增并測(cè)定了萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)線粒體COI部分基因的序列，經(jīng)過比較后確定為輪蟲的COI基因片段，從而證明使用該方法提取單只輪蟲痕量DNA的可靠性。Dingmann[16]利用0.10 g褶皺臂尾輪蟲的RNA建立了cDNA文庫(kù)。

2 輪蟲同胞物種復(fù)合類群的研究

長(zhǎng)期以來研究者都認(rèn)為輪蟲可借助外界力量進(jìn)行不同地域間的轉(zhuǎn)移，因此曾被普遍認(rèn)為是一種廣泛分布的物種。也有學(xué)者指出一些大陸上的輪蟲表現(xiàn)出了一定的地域差異。然而，Segers[17]指出，輪蟲相對(duì)于其他動(dòng)物群體來說，表現(xiàn)出了很廣的分布性，地理隔離位于次要地位。Dumont & Segers[7, 17]都指出在廣泛分布的輪蟲物種中，包含了一些隱匿的同胞物種。褶皺臂尾輪蟲是很多重要經(jīng)濟(jì)魚類的開口餌料，因此確定它的種類是很必要的。而且，同胞物種的存在可能會(huì)導(dǎo)致研究者們對(duì)水體的生態(tài)容納量和生殖類型的估計(jì)出現(xiàn)極大的誤差。研究者對(duì)未知水體樣品的采集和對(duì)隱匿物種的發(fā)現(xiàn)和描述，都大大促進(jìn)了人們對(duì)輪蟲生態(tài)多樣性的了解。然而，對(duì)很多種輪蟲來說，除非這種輪蟲“真的”是這種輪蟲，生態(tài)學(xué)研究結(jié)果并沒有什么實(shí)際的意義。例如，同一地理品系的相同物種間的形態(tài)變化可以定義為周期形變，或者是中間的生態(tài)型改變，這使得之前提出的輪蟲可以隨著季節(jié)的改變而發(fā)生形變的模式與真實(shí)的輪蟲種群組成情況有所偏差。就像King[18]對(duì)很多湖泊進(jìn)行的“種群”調(diào)查一樣，其中的結(jié)果大多數(shù)只是科學(xué)家的主觀意愿，與真實(shí)的種群個(gè)體相關(guān)性不大。沒有判斷不同物種之間的遺傳差異或者沒有研究有沒有混交現(xiàn)象的存在，就會(huì)造成大多數(shù)物種都被定義為多態(tài)性和廣泛分布的。除了更多地了解輪蟲的生物多樣性之外，對(duì)輪蟲種群中存在的隱匿物種的進(jìn)一步認(rèn)知，能促進(jìn)輪蟲研究者更深入地了解不同輪蟲種群的生態(tài)環(huán)境、種群動(dòng)力學(xué)和解決其他許多的生態(tài)和進(jìn)化問題。而對(duì)不同種類輪蟲復(fù)合類群的研究中，以褶皺臂尾輪蟲為研究對(duì)象的較多。

3 褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群的分類研究

在早期研究中，很多學(xué)者認(rèn)為褶皺臂尾輪蟲只是包括S和L兩種類型的單一的物種，但經(jīng)過長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)，S和L型輪蟲在外形、生理等方面均有明顯的不同[19]，但仍舊在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)認(rèn)為這是同種輪蟲不同品系之間的差異或季節(jié)變異。直到分子生物學(xué)的方法出現(xiàn)，對(duì)相似物種的研究才有了新的進(jìn)展。Fu等對(duì)褶皺臂尾輪蟲的等位酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩種類型的等位酶之間的差別較大，已經(jīng)超出了同一種輪蟲的不同地理品系之間的差異，而且從系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出兩種類型的輪蟲屬于兩個(gè)不同的物種[10]，Runmenga等對(duì)褶皺臂尾輪蟲兩種類型的染色體組型研究的結(jié)果再次驗(yàn)證了Fu等觀點(diǎn)[20-21]。Segers[22]根據(jù)前人的研究成果最終將褶皺臂尾輪蟲的S-型和L-型分為兩個(gè)不同的物種，即B.plicatilis和B.rotundiformis。然而，隨著研究的進(jìn)一步深入，人們又發(fā)現(xiàn)這個(gè)復(fù)合類群中還包括更多的種類。Gómez等[23]對(duì)該種輪蟲群體的等位酶研究進(jìn)行了研究，將該種輪蟲的群體分為L(zhǎng)(B.plicatilis)、SS(B.rotundiformisSS)和SM(B.rotundiformisSM)3個(gè)大的類群；同時(shí)，由于這3大類群之間存在雜合體缺失，所以L、SS和SM應(yīng)屬于不同的物種，而褶皺臂尾輪蟲應(yīng)屬于一個(gè)物種的復(fù)合類群。Hagiwara等[6]在研究SS-型輪蟲時(shí)指出，這種輪蟲從形態(tài)、交配行為和同工酶分析中都沒有表現(xiàn)出與B.rotundiformis有差異，因此SS-型輪蟲實(shí)際上就應(yīng)該是B.rotundiformis。對(duì)于這3類輪蟲更近一步的區(qū)分由學(xué)者Ciros-Pérez等[5]提出(見圖1)，并對(duì)它們進(jìn)行了重新命名：B.plicatilissensu stricto、B.ibericus和B.rotundiformis，其中B.plicatilissensu stricto屬于L型，B.ibericus屬于SM-型，B.rotundiformis屬于SS-型，平均體長(zhǎng)分別為(299±1.5)，(193.4±1.4)和(148.7±1.3) μm，平均體寬分別為(225.4±0.9)，(144.3±0.6)和(120±0.9) μm；這3種輪蟲前棘刺的形狀也有所差別，B.rotundiformis的前棘刺更尖并且突出，B.plicatilissensu stricto和B.ibericus的前棘刺則相對(duì)較鈍；除此之外，3種輪蟲休眠卵和咀嚼器都存在差異。

圖1 3種臂尾輪蟲同胞物種

A和B為Brachionusplicatilissensu stricto，C和D為Brachionusrotundiformis，E和F為Brachionusibericus.

Gómez等對(duì)該種輪蟲復(fù)合類群的生殖行為及同工酶電泳分析進(jìn)行了研究，并提出在褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群中，除了L、SS和SM 3種類群以外，還可能存在大量的其他種類輪蟲，它們與L、SS和SM 3種類群之間在生理和生態(tài)等方面都存在很大的差別[8]。Gómez等[13]對(duì)采集的57個(gè)輪蟲樣本(包括實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的已知種類)和從伊比利亞鹽湖、北非、北美、歐洲和澳大利亞采集的休眠卵進(jìn)行了COⅠ和ITS1序列分析，并結(jié)合這些輪蟲休眠卵孵化出的個(gè)體形態(tài)特征構(gòu)建出了9個(gè)一致的遺傳族系系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖2)，其中6種分布于伊比利亞半島。結(jié)果是：3個(gè)主要的系統(tǒng)發(fā)生分枝與3個(gè)已經(jīng)被命名的褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群型L，M和S型極為一致(見圖2)。Stelzer等利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定了褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群中33個(gè)樣本的基因組大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其基因組大小差異可達(dá)7倍，同時(shí)比對(duì)了該復(fù)合類群的COI和ITS1序列，發(fā)現(xiàn)有32%的輪蟲種類無法確定其分支，并且這些種類之間仍可進(jìn)行混交配對(duì)[24]。伊朗科學(xué)家最近利用DNA條形碼技術(shù)鑒定了其國(guó)內(nèi)6個(gè)內(nèi)陸湖中的15個(gè)無性繁殖品系，分離到4種輪蟲同胞物種[25]。2012年，墨西哥淡水湖中也發(fā)現(xiàn)了褶皺臂尾輪蟲，并鑒定為新的地理種群B. sp. ‘Mexico’[26]。國(guó)內(nèi)關(guān)于褶皺臂尾輪蟲分類研究中，殷旭旺等[27]通過調(diào)查大連沿岸水體中的褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群分離出了5種同胞物種，B.plicatilisYamamoto、B.plicatilisMtiller、B.rotundiformisTschugunof、B.ibericusDalian和B.hepatotomusDalian。

圖2 通過COⅠ和ITS1序列分析建立樹褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群系統(tǒng)發(fā)生樹

4 結(jié)論與展望

目前對(duì)褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群同胞物種分類的研究仍在繼續(xù)。對(duì)該種復(fù)合類群中隱匿物種的深入研究，有助于提高生態(tài)調(diào)查的準(zhǔn)確性，使生態(tài)學(xué)研究結(jié)果更為可靠，同時(shí)可以更清楚地了解一些輪蟲種類中出現(xiàn)的季節(jié)性周期形變產(chǎn)生的機(jī)理和同屬無脊椎動(dòng)物的種間差異產(chǎn)生的原因等。雖然目前人們已從褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群中鑒定出部分輪蟲，但是由于復(fù)合類群中的同胞物種大多有同域分布狀況的存在，因而確定鑒定出的各個(gè)同胞物種之間是否存在基因流動(dòng)的現(xiàn)象就尤為重要。因此，盡管目前DNA技術(shù)在輪蟲分類中的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，但是只依靠單一的研究方法很難做到準(zhǔn)確分類，只有將生態(tài)、行為、分子技術(shù)和傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法相結(jié)合，才可以最大限度的促進(jìn)輪蟲系統(tǒng)分類學(xué)的研究。

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