任善茂， 陶 勇， 徐椿慧， 莊 勛， 董曉君， 趙旭庭

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 江蘇 泰州 225300； 2. 江蘇省淮安市淮安區(qū)畜牧獸醫(yī)站， 江蘇 淮安 223200)

豬激素敏感脂肪酶(HSL)基因是影響脂肪代謝的重要候選基因之一，基因全長10～11 kb，有9個(gè)外顯子，編碼171個(gè)氨基酸[1]，定位于6q1.2[2]。豬HSL基因在不同組織中的表達(dá)存在較大差異性，在心肌和骨骼肌中HSL基因mRNA含量極少[3]。Otsu等認(rèn)為HSL基因所在的染色體區(qū)域可以作為影響豬瘦肉率、肌內(nèi)脂肪等屠宰性狀的重要區(qū)段[4]，曲亮等將HSL基因作為影響豬胴體重要性狀的候選基因進(jìn)行相關(guān)研究[5]。因此，本試驗(yàn)利用PCR-RFLP方法研究了蘇姜豬及其雜交后代群體內(nèi)HSL基因外顯子I的多態(tài)性，為進(jìn)一步分析HSL基因與豬背膘厚、瘦肉率等胴體性能的關(guān)系奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用江蘇姜曲海種豬提供的蘇姜豬、長蘇豬(長白豬×蘇姜豬)、大蘇豬(大白豬×蘇姜豬)各60頭，90 kg左右。每頭豬采集10 mL血液，ACD抗凝。采用常規(guī)的酚/氯仿/異戊醇法抽提血液DNA，乙醇沉淀，溶于TE緩沖液。使用BD-100超微量核酸蛋白分析儀測定濃度后，稀釋至50 ng/μL分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要設(shè)備與試劑

ABI梯度PCR擴(kuò)增儀(美國)，DYY-6C恒壓恒流電泳儀(北京六一)，垂直板電泳槽裝置(北京東方)，Eppendorf冷凍離心機(jī)(USA)，GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

TaqDNA聚合酶、dNTP購自上海華美生物工程公司，DNA Marker、BsaH I購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，丙烯酰胺(Acrylamide，Acr)、N-N′亞甲基雙丙烯酰胺(Bisacrylamide，Bis)購自南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)豬HSL基因序列(Genbank登錄號：AJ000483)，參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)一對引物，序列為：上游引物(PF)5′-CGCACAA TGACACA BT CA CT GGT-3′，下游引物(PR)5′-AGGCAGCGGCCGT AGAAGCA-3′。擴(kuò)增片段長度為497bp，位于HSL基因外顯子I區(qū)域。引物由上海生工生物工程有限公司合成，去離子水溶解，-20℃保存。

1.4 PCR-RFLP分析

PCR 反應(yīng)體系20 μL：10 × buffer 2 μL，dNTPs 1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.1 μL( 2U/μL)，上下游引物各0.5 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

PCR 反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性10 min； 94℃變性30 s， 59.5℃退火30 s， 72℃ 延伸30 s， 32個(gè)循環(huán)； 72℃延伸5 min； 4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切體系15 μL：10 × buffer 2 μL，BsaH I內(nèi)切酶3U，PCR 產(chǎn)物10 μL，ddH2O補(bǔ)足至15 μL， 37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)8% 聚丙烯酰胺電泳檢測，電壓6 V/cm，電泳8 h，銀染顯帶、照相、記錄并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，沒有發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約500 bp，產(chǎn)物長度與預(yù)測結(jié)果一致，可以用于進(jìn)行RFLP分析。

PCR-RFLP結(jié)果見圖2所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BsaH I限制性內(nèi)切酶消化后，表現(xiàn)出了多態(tài)性。根據(jù)條帶數(shù)和位置，判定有3種基因型，分別為AA(190 bp、307 bp)、AB(67 bp、190 bp、240 bp和307 bp)和BB(67 bp、190 bp和240 bp)基因型。其中，因片斷67 bp較小，電泳時(shí)間較長而發(fā)生彌散消失。

M：DL2000 DNA marker；1-3：PCR products

M：pBR322/MspⅠ marker；1，5：AB型；2：AA型；3，4：BB型

2.2 HSL基因外顯子I基因型和等位基因頻率

蘇姜豬及其雜交后代不同基因型檢出數(shù)和等位基因頻度見表1。由表1可見，3種基因型在蘇姜豬及其雜交后代中均檢測出，蘇姜豬有更多的等位基因A。

表1 豬HSL基因的基因型及等位基因頻率

注：括號內(nèi)為樣本數(shù)。

3 討論

豬HSL基因?yàn)檎{(diào)控豬體內(nèi)激素敏感脂肪酶的基因，外顯子I區(qū)域內(nèi)存在G→A的堿基轉(zhuǎn)換，改變了BsaH I酶識別位點(diǎn)，最終導(dǎo)致編碼氨基酸Val替換Ile，其不同等位基因在中外豬種群體中的分布差異很大[6]。強(qiáng)巴央宗等[7]在藏豬群體中檢測到HSL基因外顯子ⅠG→A突變位點(diǎn)，出現(xiàn)3種基因型，表現(xiàn)出多態(tài)性，等位基因A和G頻率分別為62.50%和37.50%，突變位點(diǎn)的基因分布均處于瘦肉型外種豬和脂肪性地方豬之間。陳利榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)瘦肉型大白豬、長白豬全部表現(xiàn)為GG基因型，山西黑豬表現(xiàn)為AA、AG和GG 3種基因型，華北雜種野豬、東北純種野豬及雜種野豬表現(xiàn)為AG和GG 2種基因型，研究結(jié)果豐富了國內(nèi)外對野豬的分子生物學(xué)研究，為野豬遺傳資源的合理開發(fā)利用提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)中，在蘇姜豬及其與長白豬、大白豬的雜交后代群體中均檢測到了HSL基因外顯子I區(qū)域內(nèi)G→A堿基突變產(chǎn)生的3種基因型，基因型頻率分布介于瘦肉型外種豬和脂肪型地方豬種之間，這與HSL的功能特性及蘇姜豬的品種來源有一定的關(guān)系。HSL主要是將白脂肪中的甘油三酯分解成游離脂肪酸和甘油[9]，因此可以推測，HSL基因外顯子I的A→G轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致的Ile→Val的替換可能影響HSL的活性，最終影響到豬的背膘厚、瘦肉率或肌內(nèi)脂肪含量。蘇姜豬是以地方豬種姜曲海豬、楓涇豬與國外豬種杜洛克豬為親本、歷經(jīng)10余年培育而成的瘦肉型新品種豬，2013年通過了國家畜禽種質(zhì)資源委員會品種審定，獲得了新品種證書[10]。因此，今后將開展HSL基因外顯子I區(qū)域內(nèi)的G→A堿基突變多態(tài)與蘇姜豬背膘厚、瘦肉率等胴體性狀的相關(guān)性研究。

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