吳曉俠,王永霞,何玲玲
(沈陽(yáng)化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142)
血清白蛋白是血漿中主要蛋白之一,具有結(jié)合和運(yùn)輸內(nèi)源及外源性物質(zhì)的作用[1].藥物進(jìn)入人體后,以游離態(tài)存在的藥物分子可透過(guò)生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)、奏效或消除;與血清白蛋白結(jié)合的部分則形成大分子物質(zhì)不能透過(guò)生物膜達(dá)到治療病痛目的,因而變成無(wú)效的藥物分子,但這種結(jié)合是可逆的,可重新釋放出有活性的藥物分子使其成為游離態(tài).所以研究藥物分子與血清白蛋白的相互作用對(duì)于闡明藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程、藥物動(dòng)力學(xué)以及藥物所具有的毒性具有非常重要的意義[2].牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ,BSA),是牛血清中的一種球蛋白,與人血清白蛋白在結(jié)構(gòu)上有高度的相似性,且BSA更廉價(jià)易得,因而它成為研究高分子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、生物學(xué)功能的理想蛋白質(zhì).鹽酸二氧丙嗪(Dioxopromethaine Hydrochloride,DPZ),化學(xué)名稱為10-(2-二甲氨基-異丙基) 吩噻嗪-5,5-二氧化物鹽酸鹽.它具有鎮(zhèn)咳平喘、祛痰、抗膽胺和局麻作用,也適用于治療蕁麻疹及皮膚瘙癢等[3].本文通過(guò)熒光光譜、紫外吸收光譜及圓二色光譜法研究了DPZ與BSA之間的相互作用.
F-7000熒光光譜儀:日本Hitachi公司;UV-2500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):日本Shimadzu公司;MOS-450圓二色光譜儀:法國(guó)Bio-logic公司;SC-15超級(jí)恒溫槽:上海比朗儀器有限公司;AL204分析天平:上海梅特勒-托利多儀器有限公司;pHS-25酸度計(jì):上海雷磁儀器廠.
BSA:美國(guó)Amresco公司;Trish-HCl緩沖溶液:pH=7.4,含0.05 mol/L NaCl 維持溶液的離子濃度;DPZ:遼寧省東港市宏達(dá)制藥有限公司;布洛芬:薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;酮基布洛芬:薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司.
1.2.1 溶液的配制
BSA用Trish-HCl緩沖溶液配制成0.1 μm/L的儲(chǔ)備液,放入冰箱4 ℃下保存.DPZ用Tris-HCl緩沖溶液配制成1.255×10-3mol/L的儲(chǔ)備液.布洛芬和酮基布洛芬溶液配制時(shí),首先用少量乙醇溶解,再用Tris-HCl緩沖溶液均配制成2.51 mmol/L的結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記物溶液.
1.2.2 熒光光譜的測(cè)定
準(zhǔn)確移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中,固定激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm,掃描范圍290~500 nm,測(cè)其發(fā)射光譜,然后再用微量進(jìn)樣器逐次加入不同體積的DPZ溶液,再次進(jìn)行測(cè)定.同樣的方法測(cè)定位點(diǎn)標(biāo)記物存在下,DPZ與BSA相互作用的熒光光譜.在這里由于DPZ在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下有吸收,因此在研究中需考慮內(nèi)濾光效應(yīng).采用公式(1)[4]對(duì)內(nèi)濾光進(jìn)行校正,計(jì)算中所用的熒光強(qiáng)度值均為校正后的熒光值.
Fcor=Fbor×e(Aex+Aem)/2
(1)
其中:Fcor為校正后的熒光強(qiáng)度;Fbor為測(cè)量到的熒光強(qiáng)度;Aex為溶液在激發(fā)波長(zhǎng)處的吸收值;Aem為溶液在發(fā)射波長(zhǎng)處的吸收值.
1.2.3 同步熒光光譜的測(cè)定
準(zhǔn)確移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中,在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm處分別掃描其同步熒光光譜,然后用微量進(jìn)樣器逐次加入不同體積DPZ溶液再次進(jìn)行掃描.
1.2.4 紫外-可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定
準(zhǔn)確移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中,掃描范圍200~500 nm,光譜帶寬1.0 nm,掃描其吸收光譜,然后用微量進(jìn)樣器加入不同體積DPZ溶液,再次進(jìn)行掃描測(cè)定.
1.2.5 圓二色光譜的測(cè)定
準(zhǔn)確移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×0.5 cm的石英比色皿中,掃描范圍200~300 nm,光譜帶寬1.0 nm,掃描速度100 nm/s,進(jìn)行掃描.在同樣的條件下再次掃描DPZ存在下BSA的圓二色光譜.
BSA分子因含色氨酸和酪氨酸等殘基而成為內(nèi)源性熒光物質(zhì).圖1為BSA與不同濃度的DPZ相互作用的熒光光譜圖.從圖1可以看出:隨DPZ濃度的增加,BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,說(shuō)明DPZ對(duì)BSA的熒光有猝滅作用.
c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16 c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13 c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19 c(DPZ)=0.40 μmol·L-1
圖1 DPZ與BSA相互作用的熒光猝滅光譜
Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ
引起熒光猝滅的原因通常有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5].動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅體和熒光物質(zhì)間的能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程;靜態(tài)猝滅是由于猝滅體和熒光物質(zhì)相互作用,形成不發(fā)光的配合物.一般情況下,熒光猝滅機(jī)理可根據(jù)不同溫度下的猝滅特征加以區(qū)分,動(dòng)態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)會(huì)隨溫度的升高而升高,對(duì)于靜態(tài)猝滅則恰好與其相反.動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程符合Stern-Volmer方程[6]:
F0/F=1+Kqτ0cQ=1+KSVcQ
(2)
其中:F0為猝滅劑不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度;F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度;KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù);cQ為猝滅劑的物質(zhì)的量濃度;Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù);τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體分子的平均壽命,BSA的τ0為6.2 ns.
實(shí)驗(yàn)分別繪制289、296、303和310 K溫度下BSA-DPZ體系的Stern-Volmer曲線(見(jiàn)圖2).對(duì)曲線進(jìn)行直線擬合,由直線斜率可以得到不同溫度下的猝滅常數(shù)(見(jiàn)表1).隨溫度的升高猝滅常數(shù)KSV降低,說(shuō)明引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因不是動(dòng)態(tài)猝滅而是靜態(tài)猝滅,并且從表1中還可以看出雙分子猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1[7],進(jìn)一步說(shuō)明DPZ對(duì)BSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅.
表1 不同溫度下DPZ對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer猝滅常數(shù)和猝滅速率常數(shù)
圖2 不同溫度下DPZ-BSA的Stern-Volmer曲線
DPZ對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅,即DPZ與BSA相互作用形成基態(tài)復(fù)合物.假設(shè)BSA與DPZ有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),可用公式(3)來(lái)求算結(jié)合常數(shù)Ka和n.
log[(F0-F)/F]=logKa+nlogcQ
(3)
其中:Ka為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù);cQ為猝滅劑DPZ的濃度.
以log[(F0-F)/F]對(duì)logcQ作圖(見(jiàn)圖3)可得一條直線,由直線的斜率和截距可求得不同溫度下DPZ對(duì)BSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見(jiàn)表2).由表2數(shù)據(jù)可知:不同溫度下的n值均接近于1,表明DPZ與BSA有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn),即形成摩爾比為1∶1的配合物;Ka隨溫度的升高而降低,則說(shuō)明兩者的結(jié)合過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程,且形成的基態(tài)復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低.
圖3 不同溫度下DPZ與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線
T/KKa/(L·mol-1)n雙對(duì)數(shù)回歸曲線相關(guān)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差2893.664×1030.884 50.998 20.017 642963.439×1030.881 60.997 20.021 953033.257×1030.878 80.996 30.024 943102.979×1030.873 40.995 30.028 20
氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力是分子間相互作用的主要作用力類型.Ross[8]等根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出判斷小分子猝滅體與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律(見(jiàn)表3).當(dāng)溫度變化范圍不大時(shí),可把焓變?chǔ)看成是一個(gè)不隨溫度變化的常數(shù),由不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka,根據(jù)下列方程可求得焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能ΔG.
(4)
ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS
(5)
其中:R為氣體常數(shù);T為實(shí)驗(yàn)溫度;Ka為相應(yīng)溫度時(shí)的結(jié)合常數(shù).
表3 熱力學(xué)函數(shù)與作用力類型的關(guān)系
DPZ與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)可以根據(jù)方程(4)和(5)并以lnKa對(duì)1/T作圖(見(jiàn)圖4)求得(見(jiàn)表4).從表4可以看出ΔG<0,表明DPZ與BSA相互作用的過(guò)程為自發(fā)進(jìn)行;ΔS>0,ΔH<0表明使DPZ與BSA結(jié)合的相互作用力為疏水作用力和靜電引力.
圖4 DPZ與BSA相互作用的van’t Hoff 曲線
T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)289-19.72296-7.17043.47-20.04303-20.38310-20.62
根據(jù)F?rster的偶極-偶極無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移理論[4],要使兩種化合物間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移,則必須滿足3個(gè)條件:(1)能量給體發(fā)熒光;(2)能量給體的熒光發(fā)射與能量受體的吸收光譜有足夠的重疊;(3)能量給體與能量受體足夠接近,最大距離不超過(guò)7 nm.實(shí)驗(yàn)測(cè)出了DPZ的吸收光譜與BSA的熒光光譜,發(fā)現(xiàn)兩光譜之間有一定的重疊,如圖5所示.
c(BSA)=c(DPZ)=0.1 μmol·L-1
根據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論,能量轉(zhuǎn)移效率E與能量給體和受體間的結(jié)合距離r及轉(zhuǎn)移效率為50 %時(shí)的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有如下關(guān)系:
(6)
(7)
(8)
其中:K2為偶極空間取向因子;N為介質(zhì)的折射指數(shù);ΦD為能量給體的熒光量子產(chǎn)率;J為能量給體的熒光發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜間的光譜重疊積分;F(λ)為能量給體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度;ε(λ)為能量受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù).
將圖5的重疊光譜分割成小矩形,并利用公式(8)可求出重疊積分J=5.094×10-15cm3·L·mol-1,再由公式(6)和(7)可求得臨界距離R0=2.254 nm,能量轉(zhuǎn)移效率E=0.1160,進(jìn)而求得結(jié)合距離r=3.161 nm.r<7 nm,表明BSA與DPZ之間能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移,但r大于轉(zhuǎn)移效率為50 %時(shí)的臨界距離R0,說(shuō)明非輻射能量轉(zhuǎn)移引起熒光猝滅的概率比靜態(tài)猝滅要小[9].
結(jié)合位點(diǎn)可以利用小分子猝滅體與位點(diǎn)標(biāo)記物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定.以酮基布洛芬和布洛芬作為siteⅠ和siteⅡ的位點(diǎn)標(biāo)記物,固定BSA的濃度,分別作3組對(duì)比實(shí)驗(yàn),并利用公式(2)對(duì)3組熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理(見(jiàn)圖6),通過(guò)計(jì)算得到酮基布洛芬和布洛芬存在下DPZ與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見(jiàn)表5).由表5可知:布洛芬的存在對(duì)DPZ與BSA的Ka和n幾乎沒(méi)有影響,而在酮基布洛芬存在下Ka和n顯著降低,表明酮基布洛芬占據(jù)了DPZ與BSA的結(jié)合位點(diǎn),說(shuō)明siteⅠ為DPZ在BSA上的結(jié)合位點(diǎn).
圖6 結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記物存在條件下DPZ與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線
標(biāo)記物Ka/(L·mol-1)n雙對(duì)數(shù)回歸曲線相關(guān)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差空白3.664×1030.884 50.998 20.017 64布洛芬3.685×1030.887 50.993 60.033 31酮基布洛芬1.042×1030.766 90.995 60.023 92
2.7.1 同步熒光光譜
利用蛋白質(zhì)的同步熒光光譜可以了解小分子猝滅體對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響,紅移表明蛋白質(zhì)所處環(huán)境的疏水結(jié)構(gòu)有所瓦解,極性在增強(qiáng),而藍(lán)移則恰恰相反[10].固定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的間距Δλ,Δλ=15 nm為蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的熒光,Δλ=60 nm則是色氨酸殘基的熒光.圖7為DPZ存在下BSA的同步熒光光譜.
c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16 c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13 c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19 c(DPZ)=0.40 μmol·L-1
圖7 含不同濃度DPZ的BSA溶液的同步熒光光譜
Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ
由圖7可見(jiàn):隨著DPZ濃度的不斷增加BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,Δλ=15 nm時(shí)酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有改變,而Δλ=60 nm時(shí)色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)由281 nm紅移至284 nm,說(shuō)明隨DPZ的不斷加入,色氨酸殘基所處環(huán)境的極性增強(qiáng),使色氨酸殘基更多的暴露于所處的溶劑中.上述同步熒光表明DPZ的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變.
2.7.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜
紫外-可見(jiàn)吸收光譜也是證實(shí)蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化的一種簡(jiǎn)單有效的方法.蛋白質(zhì)在220和278 nm處有兩處紫外吸收峰,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)生色基團(tuán)所處的環(huán)境發(fā)生改變時(shí),紫外吸收光譜也會(huì)隨之改變.圖8為DPZ與BSA相互作用的吸收光譜.
c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16 c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13 c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19 c(DPZ)=0.40 μmol·L-1
圖8 DPZ與BSA相互作用的吸收光譜
Fig.8 Absorption spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ
由圖8可見(jiàn):BSA在279 nm處有一特征吸收峰,隨DPZ的加入,其吸收峰呈明顯的增色效應(yīng),且發(fā)生紅移.該現(xiàn)象說(shuō)明DPZ與BSA發(fā)生了相互作用,使BSA分子的肽鏈伸展,包圍在BSA分子內(nèi)部氨基酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來(lái),從而使279 nm處的吸收峰的吸收增強(qiáng),同時(shí)使疏水作用增強(qiáng),吸收峰紅移.
2.7.3 圓二色光譜
圓二色(Circular dichroism,簡(jiǎn)稱CD)光譜是研究稀溶液條件下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要工具.由BSA及BSA-DPZ混合溶液的CD光譜圖(見(jiàn)圖9)可知:BSA在222 nm和208 nm處分別有一特征負(fù)峰,這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征.本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)208 nm處的特征峰強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算,分析DPZ對(duì)BSA構(gòu)象的影響.采用公式(9)、(10)[11]可以求得不同條件下BSA分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量.
(9)
(10)
其中:MRE為平均殘基橢圓率;cP為蛋白質(zhì)物質(zhì)的量濃度;n為蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)目(BSA,n=582);l為光路的長(zhǎng)度(本實(shí)驗(yàn)中l(wèi)=0.5 cm);MRE208為208 nm處的MRE值;4 000為β-折疊和無(wú)歸卷曲構(gòu)象跨過(guò)208 nm的MRE值;33 000為純?chǔ)?螺旋在208 nm的MRE值.
c(BSA)=1.0 μmol·L-1,c(DPZ)=5.0 μmol·L-1
在本實(shí)驗(yàn)條件下,BSA分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量為55.64 %,DPZ的加入使得負(fù)峰強(qiáng)度減小,即α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量在下降,降至50.41 %.BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的降低是由于DPZ與肽鍵中氨基酸殘基結(jié)合,從而在一定程度上破壞了蛋白質(zhì)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致BSA分子肽鏈的伸展而引起的.綜合以上同步熒光光譜、吸收光譜和圓二色光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,DPZ與BSA的相互作用使BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變.
在模擬生理?xiàng)l件下,用熒光光譜、紫外吸收光譜及圓二色光譜研究DPZ與BSA的相互作用,得到以下結(jié)論:
(1) DPZ對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅,形成摩爾比為1∶1的復(fù)合物.
(2) 兩者之間的主要作用力為疏水作用力和靜電引力.
(3) 通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論求得DPZ與BSA殘基的結(jié)合距離r=3.161 nm,r<7 nm,表明兩者之間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移,但r大于轉(zhuǎn)移效率為50 % 時(shí)的臨界距離R0,說(shuō)明非輻射能量轉(zhuǎn)移引起熒光猝滅的概率比靜態(tài)猝滅要小.
(4) 利用位點(diǎn)標(biāo)記物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DPZ在BSA上的結(jié)合部位為siteⅠ位.
(5) 同步熒光光譜、吸收光譜及圓二色光譜的研究結(jié)果表明,DPZ能使BSA的構(gòu)象發(fā)生改變.
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