麥秀英， 徐 柳， 李 萍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都610031)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)生的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約22～25個(gè)核苷酸，其通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)的不完全性互補(bǔ)配對(duì)，引起轉(zhuǎn)錄抑制或者下調(diào)，從而參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育和維持機(jī)體正常生理功能[1]。miRNA-21是腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)最普遍的microRNA,其大多數(shù)靶基因都是抑癌基因[2]。通過(guò)功能抑制發(fā)現(xiàn)，miR-21幾乎牽涉致癌的每個(gè)領(lǐng)域：促進(jìn)細(xì)胞的增殖，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，基因組不穩(wěn)定和突變，炎癥，復(fù)制永生化，代謝異常，血管生成，逃避細(xì)胞凋亡，免疫破壞和生長(zhǎng)抑制[3]。因此研究miRNA在腫瘤中作用機(jī)制的關(guān)鍵是要準(zhǔn)確找到其靶基因，并了解miRNA與其靶基因之間的相互作用。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)miR-21的靶基因，并對(duì)其靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路富集分析，為深入研究miR-21在癌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制做理論分析。

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來(lái)生物領(lǐng)域中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，其調(diào)控體內(nèi)多種重要的細(xì)胞進(jìn)程包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和腫瘤的形成[3]。其中MiR-21是研究較多的miRNA，研究結(jié)果表明其多與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，包括食管癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肝癌及結(jié)腸癌等。結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展與miR-21及其靶基因有著密切的關(guān)系，敲低結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中miR-21會(huì)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性[4]；在活性氧(ROS)/AMPK/mTOR/AP1/4E-BP1通路中，抑制糖醛還原酶(AR)的表達(dá)，會(huì)促使miR-21的表達(dá)水平下調(diào)，使其靶基因PDCD4的表達(dá)水平增加，從而阻止生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的生長(zhǎng)[5]；而結(jié)腸癌中過(guò)表達(dá)miR-21會(huì)降低PDCD4蛋白量，刺激癌細(xì)胞入侵，內(nèi)滲和轉(zhuǎn)移[6]。這些均表明結(jié)腸癌的發(fā)生與miR-21的表達(dá)量之間有密切關(guān)系。因此通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-21的靶基因及其靶基因可能參與的信號(hào)通路對(duì)研究miR-21在結(jié)腸癌發(fā)生中的功能及作用機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義，也為尋找結(jié)腸癌的治療靶點(diǎn)提供方向。

研究表明miR-21在多種癌癥中均表達(dá)上調(diào)，但其靶基因多數(shù)只在一種癌癥中被驗(yàn)證，只有少數(shù)幾個(gè)靶基因同時(shí)在幾種癌癥中被發(fā)現(xiàn)，如Cdc25A、TGFβR2和Sprouty均只在結(jié)腸癌中證實(shí)為miR-21的靶基因，在其他癌癥中是否為miR-21的靶基因還有待進(jìn)一步驗(yàn)證；而PDCD4在結(jié)腸癌、乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤中均證實(shí)為miR-21的靶基因，PTEN在結(jié)腸癌、肝癌和食管癌中均為miR-21的靶基因。因此，在線工具預(yù)測(cè)的miR-21的靶基因和其他癌癥或疾病中miR-21的靶基因，是否為結(jié)腸癌中miR-21的靶基因還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

應(yīng)用miRBase(http://www.mirbase.org/)、miRecords(http://mirecords.biolead.org/)[7]、TargetScan6.2(http://www.targetscan.org/)[8-11]、Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)[12]、miRanda(http://www.microrna.org/)[13]、BINGO軟件和DAVID(靶基因 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.2 方法

搜索miRBase查找不同哺乳動(dòng)物的miR-21的成熟序列；

使用miRecords、TargetScan6.2、Pictar和miRanda 4種不同在線工具對(duì)miR-21潛在的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，取預(yù)測(cè)結(jié)果的交集。4種工具預(yù)測(cè)靶基因的算法不同，所得預(yù)測(cè)結(jié)果均是其算法的最優(yōu)結(jié)果，故取4種軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集提高預(yù)測(cè)可信度；

查找已有文獻(xiàn)報(bào)道的miR-21的靶基因和miRrecords中已獲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miR-21的靶基因；

使用cytoscape的BINGO插件和DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有miR-21的靶基因用基因本體(Gene Ontology，GO)進(jìn)行功能富集分類，BINGO用超幾何分布算法計(jì)算出P值，DAVID 用Fisher Exact TEST計(jì)算P值，均以P<0.05為顯著性閾值，得到具有統(tǒng)計(jì)意義的高頻率注釋和基因集合在GO類別上的分布信息；

用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG對(duì)miR-21的所有靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-21的保守性

通過(guò)搜索miRBase發(fā)現(xiàn)hsa-mir-21位于染色體上17q23.2，又分別檢索人、鼠、家犬和猩猩等7個(gè)物種的miR-21的成熟序列，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)物種的miR-21序列相似度極高，表明miR-21在不同物種間具有高度的保守性(見(jiàn)表1)。

表1 不同物種的miR-21的成熟序列

2.2 miR-21靶基因的預(yù)測(cè)

用TargetScan、PicTar、MiRanda和miRecords在線工具預(yù)測(cè)miR-21靶基因，分別得到164個(gè)、175個(gè)、3451個(gè)和2712個(gè)靶基因，取預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，得到26個(gè)miR-21的靶基因(見(jiàn)表2)。

表2 4種在線工具預(yù)測(cè)mir-21靶基因的交集

查找文獻(xiàn)得到在不同疾病中已證實(shí)的miR-21的靶基因42個(gè)(見(jiàn)表3)，其中Buscaglia等綜述了經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miR-21的靶基因[14]，miR-21的大多數(shù)靶基因都與癌癥的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

在miRecords中，已證實(shí)的miR-21的靶基因有39個(gè)(見(jiàn)表4)，其中18個(gè)靶基因是源自對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行基因芯片和qRT-PCR的分析結(jié)果：抑制乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，這18個(gè)靶基因均表達(dá)上調(diào)；而通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，其中BMPR2、IL6R、SOCS5、GLCCI1、APAF1、SLC16A10、SGK3、RP2、CDK6和PDCD4這10個(gè)基因與miR-21的序列至少有7-mer的種子匹配， BTG2 和 SESN1與miR-21有6-mer的種子匹配，而CDKN1A、FAS、FAM3C、HIPK3、PRRG4和ACTA2雖在抑制miR-21表達(dá)后其表達(dá)上調(diào)但與miR-21無(wú)種子匹配[15]，這些與miR-21無(wú)匹配的靶基因可能為其直接靶基因也可能為其間接靶基因需要進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

將預(yù)測(cè)的靶基因，查找文獻(xiàn)獲得的靶基因和miRecords中已驗(yàn)證的靶基因匯總，得到無(wú)重復(fù)的靶基因95個(gè)，作為進(jìn)行下一步分析的基因集合。

表3 查找文獻(xiàn)得到mir-21靶基因

表4 miRecords中驗(yàn)證的has-mir-21的靶基因

2.3 mir-21靶基因的GO分析

為從基因?qū)用嬲J(rèn)識(shí)miR-21的靶基因，對(duì)集合中的95個(gè)基因進(jìn)行GO分類富集分析和分類層次網(wǎng)絡(luò)的圖形化顯示。GO注釋描述得到77個(gè)基因的GO生物學(xué)過(guò)程注釋信息，將這77個(gè)基因投到GO的生物學(xué)過(guò)程上，根據(jù)P值選取結(jié)果，P值越小結(jié)果的可信度越高。結(jié)果(見(jiàn)圖1和圖2)發(fā)現(xiàn)miR-21的靶基因主要富集于生物進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程、新陳代謝、發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程。圖柱越高表示參與此生物過(guò)程的基因越多，柱上方的數(shù)字為參與生物進(jìn)程的基因數(shù)。

圖1 mir-21靶基因在BINGO中的GO分析部分結(jié)果(生物進(jìn)程)

圖2 miR-21靶基因GO分類的部分層次網(wǎng)絡(luò)Fig 2 The Hierarchical Network of GO classification節(jié)點(diǎn)代表一種生物進(jìn)程，節(jié)點(diǎn)大小表示參與此進(jìn)程的基因數(shù)量，顏色深淺表示P值大小，顏色越深P值越小，白色節(jié)點(diǎn)只起連接兩個(gè)生物進(jìn)程的作用，無(wú)實(shí)際研究意義。

為使基因分類富集分析結(jié)果更準(zhǔn)確，再對(duì)集合中的95個(gè)基因用DAVID進(jìn)行GO分類富集分析。GO注釋描述得到44個(gè)基因的GO生物學(xué)過(guò)程注釋信息，將這44個(gè)基因投到GO生物學(xué)過(guò)程，根據(jù)P值選取結(jié)果。結(jié)果(見(jiàn)圖3)表明mir-21靶基因主要富集于調(diào)控轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、基因表達(dá)和凋亡等生物進(jìn)程(P<0.05，圖3)。圖柱越高表示參與此生物過(guò)程的基因越多，柱上方的數(shù)字為參與生物進(jìn)程的基因數(shù)。

BINGO和DAVID進(jìn)行的GO分類富集分析，結(jié)果表明mir-21的靶基因多富集于調(diào)控轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡等生物進(jìn)程，這些生物進(jìn)程的異常均可能引起癌癥的發(fā)生。

2.4 mir-21靶基因集合的KEGG通路分析

利用已有的生物通路對(duì)匯總的95個(gè)靶基因進(jìn)行生物通路富集分析，KEGG通路富集分析得到44個(gè)基因的信號(hào)通路富集。預(yù)測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖4)顯示，在通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中miR-21的靶基因顯著富集于各種癌癥(小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤和結(jié)腸癌等)疾病通路中及p53 信號(hào)通路，Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞周期等信號(hào)通路。MiR-21的靶基因集合顯著富集在幾個(gè)癌癥通路和與癌癥有關(guān)的信號(hào)通路。

圖3 mir-21靶基因DAVID的GO分析(生物進(jìn)程)部分結(jié)果

3 討論

對(duì)mir-21的靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于癌癥中通路，如P53信號(hào)通路，Jak-STAT信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路及與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，并參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物進(jìn)程。眾所周知，P53、Jak-STAT、MAPK信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系[16-17],P53信號(hào)通路已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但其與miR-21之間的相互作用卻很少研究，有報(bào)道稱抑制miR-21表達(dá)將有益于對(duì)p53缺陷的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)的癌癥療法[18]；STAT3是jak-STAT信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子，其是癌癥和白血病的著名預(yù)后因素之一[19]，已有研究表明STAT3為miR-21的靶基因，因此研究結(jié)腸癌中調(diào)控jak-STAT信號(hào)通路的基因十分必要；MAPK信號(hào)通路主要指ERK、JNK和P38途徑，其參與調(diào)控多種生理過(guò)程，在惡性人胚胎肺成纖維細(xì)胞(HELF)中，miR-21及其靶基因PDCD4和Spry1均是JNK/c-jun和ERK/NF-кB的調(diào)節(jié)子，表明miR-21對(duì)MAPK通路起重要的調(diào)節(jié)作用[20]。

圖4 mir-21靶基因KEGG通路富集分析

通過(guò)對(duì)miR-21靶基因進(jìn)行生物進(jìn)程分析，可以從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)層面挖掘miR-21的調(diào)控機(jī)制，看到基因?qū)用婵床坏降男畔?，從而在調(diào)控層面更全面地了解miR-21的生物學(xué)功能，對(duì)了解miR-21對(duì)結(jié)腸癌的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。但所預(yù)測(cè)的miR-21靶基因及文獻(xiàn)中查找到的靶基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中是否為miR-21的直接靶基因或間接靶基因需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)mir-21靶基因并結(jié)合部分驗(yàn)證的靶基因，對(duì)mir-21靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因多數(shù)參與癌癥發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路，并具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝的功能。由此為進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR、熒光素酶報(bào)告基因，MTT、Western blotting等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mir-21在結(jié)腸癌細(xì)胞中的靶基因及靶基因的作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

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