吳茜茜， 田曉敏

(合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系， 合肥 230022)

淀粉是一種來源廣泛、可再生性的天然多糖類物質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于食品、面包、啤酒等行業(yè)。但是隨著淀粉加工行業(yè)的發(fā)展，對淀粉性質(zhì)的要求也呈現(xiàn)多樣化，原淀粉的性質(zhì)已不適應(yīng)于很多領(lǐng)域，人們需要通過酸解或酶法等對淀粉進(jìn)行改造[1-2]，以滿足淀粉加工行業(yè)的新要求。由于酶法加工淀粉不僅提高了淀粉利用效率，同時也帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)利益，因此淀粉酶或淀粉降解酶在食品加工行業(yè)中得到廣泛地應(yīng)用。所涉及到的淀粉酶主要為α-淀粉酶、β-淀粉酶、脫支酶和糖苷酶，與其他淀粉酶相比較，脫支酶的研究相對滯后，主要研究內(nèi)容多為普魯蘭酶和異淀粉酶二大類酶[3-5]。

異淀粉酶(Isoamylase，EC 3.2.1.68)是能夠?qū)Ｒ恍缘厍虚_支鏈淀粉、糖元、α或β限制性糊精分支點(diǎn)中的a-1,6糖苷鍵，其產(chǎn)物以線性麥芽寡聚糖為主[6]。與普魯蘭酶相比，其具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)能同時從內(nèi)部和外部水解支鏈淀粉的分支點(diǎn)；2)其催化反應(yīng)具有不可逆性；3)異淀粉酶的催化活性不會被麥芽糖所抑制[7]。如今與其他淀粉酶協(xié)同作用，已應(yīng)用于直鏈淀粉、抗性淀粉、淀粉糖漿(高葡萄糖漿、高麥芽糖漿)、啤酒、低聚寡糖和酒精生產(chǎn)等領(lǐng)域[8-11]。

目前報道產(chǎn)異淀粉酶的微生物多為細(xì)菌，如Pseudomonas[12-13]，Bacillus[14-15]，Escherichia[16-17]，部分為真菌如Saccharomycessp.[18],Lipomycessp.[19],Rhizopusoryzae[20]。來自不同微生物的異淀粉酶，其耐酸性和熱穩(wěn)定性存在著差異，近年來人們熱衷于尋找有實用價值的異淀粉酶產(chǎn)生菌。本課題組從浙江蒼南附近海域分離篩選到15株產(chǎn)異淀粉酶的海洋真菌，其中包括1株產(chǎn)偏酸性異淀粉酶活力較高的菌株(黑曲霉PZ331)，其合成的異淀粉酶耐酸性較好，且與糖化酶的最適pH值相近，適應(yīng)現(xiàn)行酶法水解淀粉的生產(chǎn)條件，在淀粉糖化工藝中有一定的應(yīng)用前景。鑒于此，本試驗利用響應(yīng)面實驗對PZ331異淀粉酶的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 黑曲霉(Aspergillus niger)PZ331，由合肥學(xué)院微生物實驗室保存。

1.2 液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)條件

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯淀粉10，檸檬酸氫二銨8，磷酸氫二鉀3，硫酸亞鐵0.01，硫酸鎂1，起始pH值4.2。

1.2.2 培養(yǎng)條件 按1%接種量接種后(孢子濃度約為107cfu/mL)，放置在28℃，180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)，定時取樣測定異淀粉酶的酶活。

1.3 底物溶液的配制

稱取支鏈淀粉1.00 g，用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.2)加熱溶解后定容至100 mL，為1.0%的底物溶液。

1.4 異淀粉酶酶活力的測定

1.4.1 異淀粉酶酶活單位的定義[3]

在50℃、pH值4.5 條件下，液化可溶性糯米淀粉變?yōu)橹辨湹矸酆秃c碘的呈色反應(yīng)由紅色變?yōu)樗{(lán)色，光密度增加 0.1 規(guī)定為 10個酶活單位。

1.4.2 測定方法

酶活力測定以1%支鏈淀粉為底物，反應(yīng)體系包括2.5 mL底物，0.5 mL發(fā)酵上清液，于50℃準(zhǔn)確反應(yīng)1 h。立即取出2 mL 反應(yīng)液，加入0.02 mol/L硫酸25 mL中止反應(yīng)，再加入2 mL碘液，用蒸餾水定容至50 mL。對照操作同上，但不加入發(fā)酵上清液，以蒸餾水代替發(fā)酵上清液。放置15 min 后，在620 nm波長處測定光密度，計算酶活力。酶活力公式為U(μ/mL)=(OD×n×10)/(0.1×0.5)，式中OD為吸光值，n為酶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源的選擇

分別用10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、乳糖、可溶性淀粉、復(fù)合碳源(m葡萄糖：m可溶性淀粉=1∶2)取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的馬鈴薯淀粉，以考察不同的碳源對黑曲霉PZ331產(chǎn)異淀粉酶的影響。實驗結(jié)果見表1。

從表1可以看出，二糖對異淀粉酶合成的影響大于多糖、單糖的影響，Lai等[21]也報道了當(dāng)葡萄糖濃度維持在較低水平時，麥芽糖(二糖)可以促進(jìn)Pseudomonasamyloderamosa異淀粉酶的合成；碳源對黑曲霉PZ331產(chǎn)異淀粉酶影響大小依次為：蔗糖>麥芽糖>復(fù)合碳源>可溶性淀粉>糊精>乳糖>葡萄糖； 較高濃度的葡萄糖不利于異淀粉酶的合成，這是因為異淀粉酶屬于誘導(dǎo)酶，其合成受到葡萄糖濃度的反饋抑制，高濃度葡萄糖會對產(chǎn)酶有一定抑制作用；復(fù)合碳源中含有低濃度葡萄糖，既可以滿足微生物前期生長的需求，還在一定程度上有效解除了葡萄糖對異淀粉酶的抑制作用，此時異淀粉酶活高于以葡萄糖為供試碳源時的酶活。Ghosh等[21]也報道了葡萄糖對Rhizopusorezae異淀粉酶合成有抑制作用。當(dāng)供試碳源為蔗糖時，此時異淀粉酶的酶活最高，達(dá)到了105.6 μ/mL。故選擇蔗糖為最適碳源開展后續(xù)試驗。

2.2 最適氮源的選擇

表1 不同的碳源對黑曲霉PZ331產(chǎn)異淀粉酶的影響

表2 不同氮源對黑曲霉PZ331產(chǎn)異淀粉酶的影響

分別選用8 g/L的酵母、牛肉膏、蛋白胨、磷酸氫二銨、硫酸銨、硝酸銨、檸檬酸氫二銨作為供試氮源，實驗結(jié)果見表2。

從表2可以看出，對黑曲霉 PZ331 產(chǎn)異淀粉酶影響大小依次為：硝酸銨>蛋白胨>檸檬酸氫二銨>磷酸氫二銨>牛肉膏>酵母>硫酸銨。當(dāng)以硝酸銨為氮源時酶活最大，蛋白胨其次；Ghosh等[21]也選用蛋白胨和 (NH4)2HPO3為氮源，培養(yǎng)Rhizopusorezae合成異淀粉酶。從酶活大小和經(jīng)濟(jì)角度綜合考慮，本文選擇硝酸銨作為氮源。

2.3 Plackett-Burman試驗

在實驗選用N=12的Plackett-Burman 設(shè)計分析蔗糖、硝酸銨、培養(yǎng)溫度、起始pH值、接種量(孢子濃度約為107cfu/mL)5個因素對異淀粉酶合成的影響，并設(shè)3個空白為誤差分析項。各因素均取兩個水平：高水平“1”和低水平“-1”，實驗設(shè)計和結(jié)果見表3；各因素所代表的參數(shù)、水平及因素效應(yīng)評價見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果

表4 Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及效應(yīng)評價

由表4得知，根據(jù)t-檢驗，選擇對產(chǎn)酶的影響顯著且可信度在≥ 92%的硝酸銨(X2)，接種量(X3)，溫度(X5)3個因子，作為主效因子進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，其它因素在此水平上不顯著。

2.4 響應(yīng)面試驗

通過上述Plackett-Burman實驗設(shè)計得到3個顯著因素。其試驗因素和水平如下：

硝酸銨(X1，g/L)：-1：5； 0：10； 1：15

接種量(X2，%)： -1：1； 0：2；1：3

溫度(X3，℃)：-1：28；0：30； 1：35

響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。由SAS 8.1軟件擬合得多項式回歸模型為：

Y1 = 131.3267 + 9.915*X1 + 9.6575*X2 + 8.455*X3-28.78958*X1*X1 + 9.6825*X1*X2-0.9225*X1*X3-32.37958*X2*X2-26.4475*X2*X3-13.66958*X3*X3

方差分析見表6,回歸方程系數(shù)的估計見表7。由表6、表7可知回歸方程的一次項、平方項的系數(shù)和均方差較大，交互項的系數(shù)和均方差較小，說明3個因素之間交互效應(yīng)較小。該模型P0.00641<0.05，這說明方程與實際情況擬合良好，R2=95.70%，因此可以利用此模型代替上述3個主要因子對黑曲霉異淀粉酶合成的影響進(jìn)行分析和預(yù)測。真實響應(yīng)面擬合見圖1。

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表6 回歸方程的方差分析

表7 回歸方程偏回歸系數(shù)評估計值

對回歸方程求導(dǎo)數(shù)，當(dāng)響應(yīng)值最大估計值為131.32，此時編碼X1=0，X2=0，X3=0。預(yù)測優(yōu)化后異淀粉酶酶活大小為131.32 μ/mL，對應(yīng)的培養(yǎng)基成分為硝酸銨1%，溫度30℃，接種量2%。為了驗證預(yù)測值，用以上得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方重復(fù)試驗3次，結(jié)果為：132.1 μ /mL，131.6 μ/mL，131.9 μ/mL，平均值為131.87 μ/mL，與預(yù)測值有較好地擬合性，證明了模型的可行性。

a 硝酸銨(X1)和接種量(X2)的交互影響等高線圖

b 溫度(X3)和接種量(X2)的交互影響等高線圖

c 硝酸銨(X1)和溫度(X3)的交互影響等高線圖

圖2 PZ311優(yōu)化前后產(chǎn)酶曲線

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化前后產(chǎn)酶曲線的比較

優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖10，硝酸銨10，磷酸氫二鉀3，硫酸亞鐵0.01，硫酸鎂1，起始pH值4.2。

按2%接種量(孢子濃度為107cfu/mL)接入上述優(yōu)化培養(yǎng)基，于30℃，180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定異淀粉酶活。

從圖2可以看出，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中PZ331異淀粉酶最高酶活為80.5 μ/mL；而通過優(yōu)化后異淀粉酶最高酶活為137.3 μ/mL；比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了1.71倍左右。

3 討論

近年來，關(guān)于普魯蘭酶的基礎(chǔ)研究及在淀粉加工行業(yè)的應(yīng)用報道較多，其與糖化酶等酶協(xié)同水解支鏈淀粉，已經(jīng)廣泛地用于生產(chǎn)葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產(chǎn)品，而異淀粉酶與糖化酶等酶協(xié)同水解支鏈淀粉的報道較少。

異淀粉酶和普魯蘭酶均屬于GH13家族淀粉脫支酶，具有典型的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，但二者具有較大的底物差異性，具體表現(xiàn)為：普魯蘭酶對低分子量糊精等水解活性較強(qiáng)，對大分子支鏈淀粉水解活力較弱，對分支密集的動物淀粉幾乎沒有水解作用；而異淀粉酶對分子量較大的支鏈淀粉和動物淀粉水解活力較強(qiáng)[22]。因此可以預(yù)測在不久的將來，異淀粉酶、普魯蘭酶和糖化酶等酶可以組成配伍酶，將在高麥芽糖漿、海藻糖、環(huán)糊精、抗性淀粉等淀粉加工領(lǐng)域中得到廣泛地應(yīng)用，有利于提高支鏈淀粉、動物淀粉的轉(zhuǎn)化率，縮短反應(yīng)時間，從而達(dá)到提高設(shè)備的利用率，降低生產(chǎn)成本的目的。

4 結(jié)論

1)通過單因素實驗，確定了黑曲霉產(chǎn)異淀粉酶的最適碳源及氮源為蔗糖和硝酸銨；2)采用Plackett-Burman設(shè)計了2水平5因素的試驗，最終確定了硝酸銨、培養(yǎng)溫度、接種量為主要影響因素。3)采用響應(yīng)面分析法確定了上述3個主要因素的最優(yōu)水平，硝酸銨為1g/L、培養(yǎng)溫度為30℃，接種量2%(孢子濃度為107cfu/mL)。4)在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，測得異淀粉酶的酶活為137.3 μ/mL，比優(yōu)化前約提高了1.71倍，為后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱香玉. 異淀粉酶酶解玉米淀粉的性質(zhì)及其成膜性研究[D]. 天津：天津大學(xué), 2010.5.

[2]沈 娜, 李亦蔚, 汪霞麗, 等. 葛根淀粉性質(zhì)及改性方法研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(4): 245-249.

[3]王紅梅, 潘仁瑞, 吳茜茜, 等. 微生物脫支酶研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2011, 13: 41-43.

[4]胡先望, 陳 朋, 梁 寧, 等. 產(chǎn)異淀粉酶嗜熱菌選育及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(01): 8-11.

[5]Ray R R. Microbial isoamylases: an overview[J]. American Journal of Food Technology, 2011, 6(1):1-18.

[7]李由然. 脫枝酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 無錫：江南大學(xué), 2009,6.

[8]侯炳炎. 嶄露頭角的異淀粉酶[J]. 天津輕工, 1995(2): 31-32.

[9]白 虹, 葛世軍. 大豆β-淀粉酶、產(chǎn)氣氣桿菌異淀粉酶在蝦殼幾丁質(zhì)上的固定化及在麥芽糖生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1992(4): 19-21.

[10]高群玉, 楊宣功. 用異淀粉酶改進(jìn)淀粉膜的研究[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 1993, 21(2): 60-68.

[11]田曉敏.馬鈴薯磷酸寡糖制備及其相關(guān)酶系的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009, 6.

[12]Amemura, A, Chakraborty R, Fujita M, et al. Cloning and nucleotide sequence of the isoamylase gene fromPseudomonasamyloderamosaSB-15[J]. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263: 9271-9275.

[13]Chen P H, Lin L L, Hsu W H. Expression ofPseudomonasamyloderamosaisoamylase gene inSaccharomycescerevisiae[J]. Biotechnology Letters, 1998, 20: 735-739.

[14]王曉燕, 李俊俊, 楊云娟, 等. 三株異淀粉酶酶源菌株的篩選分離及部分酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(6): 31-35.

[15]Prayitno N R, Melliawati R, Sukara E. Screening of thermostable inulinase and isoamylase producing microbes from several geothermal hot springs in Indonesia[J]. Annual Reports on ICBiotech Japan, 1996, 19: 753-770.

[16]Abe J, Ushijima C, Hizukuri S. Expression of the isoamylase gene ofFlavobacteriumodoratumKU inEscherichiacoliand identification of essential residues of the enzyme by site directed mutagenesis [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65: 4263-4270.

[17]Jeanningros R, Creuzet N, Frixon C, et al. A debranching enzyme inEscherichiacoli[J]. Biochemical Society Transactions, 1975, 3: 336-337.

[18]Ma Y J, Lin L L, Chien H R. Efficient utilization of starch by a recombinant strain ofSaccharomycescerevisiaeproducing glucoamylase and isoamylase[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2000, 31(1): 55-59.

[19]Spencer M I. Extracellular isoamylase produced by the yeastLipomyceskononenkoae[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 44: 1253-1257.

[20]Ghosh B, Ray R R. Extra-cellular isoamylase production byRhizopusoryzaein solid-state fermentation of agro wastes [J]. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2011, 54(5): 867-876.

[21]Ghosh B, Ray R R. Induction and carbon catabolite cepression of isoamylase production inRhizopusoryzaePR71 [J]. Microbiology, 2014, 83(1/2):135-139.

[22]段緒果. 淀粉脫支酶的重組表達(dá)及分子改造究[D]. 無錫：江南大學(xué), 2013,6.