王 磊, 劉棟然, 蘇琳瑛, 劉朝良

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230036)

Septin蛋白分子量在30～65 kD之間，都含有保守的GTP結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，最早在1971年通過篩選出芽酵母突變體而發(fā)現(xiàn)的[1]。后來septin陸續(xù)在線蟲[2]、果蠅[3]、哺乳動物[4]中發(fā)現(xiàn)，但在原生生物和植物基因組信息中未發(fā)現(xiàn)它的存在。其中，septin在酵母、果蠅以及人中的研究較多，功能也較明確。酵母中有7個septin，已證實其參與了酵母胞質(zhì)分裂過程、膜分割區(qū)的界限設(shè)定(compartmentalization)、囊泡運輸及分泌過程、有絲分裂紡錘體的定向等過程[5]。果蠅中有5個septin，主要調(diào)節(jié)細胞質(zhì)分裂及分裂末期卵裂溝的遷移過程，并且septin蛋白之間形成復(fù)合物具有結(jié)合和水解GTP的活性[6]。在人類基因組信息中鑒定了13個septin基因，分為4個亞家族，并且有變異剪接現(xiàn)象。人septin蛋白的功能多樣，不僅體現(xiàn)在參與了細胞內(nèi)物質(zhì)的運輸與分泌(包括調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)與血小板的釋放反應(yīng)等)過程，而且已明確了septin家族與Parkinson病、Alzheimer病、Down′s綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，白血病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌等腫瘤，志賀(氏)桿菌和立克次氏體之類的病毒和細菌在內(nèi)的病原體感染，男性不孕癥以及遺傳性神經(jīng)肌肉萎縮(HNA)等疾病發(fā)生有關(guān)[3]。

柞蠶(AntheraeapernyiGuerin-Meneville)是鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬的一種野外放養(yǎng)的經(jīng)濟昆蟲，以柞樹(Xylosmaracemosum)葉為食料，繭可繅絲，蛹可食用或藥用，具有重要的經(jīng)濟價值。柞蠶主要分布在中國遼寧、河南及山東等省，在朝鮮、韓國、俄羅斯、烏克蘭、印度和日本等國亦有少量分布。由于柞蠶具有體型大，飼養(yǎng)容易等特點，對柞蠶進行了大量的轉(zhuǎn)基因柞蠶研究及利用柞蠶進行生物反應(yīng)器來表達外源蛋白等研究具有很好的前景[7]。本研究利用前期柞蠶cDNA文庫獲得的柞蠶septin基因部分片段，設(shè)計RACE引物克隆了柞蠶septin基因全長，對序列進行了生物信息學(xué)分析，并研究了該基因在不同組織中的表達情況，也利用大腸桿菌對柞蠶septin進行了體外原核表達，為進一步研究septin蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試柞蠶品種為 “克青”。4月初幼蟲孵化后用新鮮的麻櫟(Quercusacutissima)葉在室溫下飼喂，1～3齡小蠶期采用塑料袋育，4～5齡大蠶期采用插枝育[8]。

1.2 總RNA提取

總RNA提取按照Trizol法進行。柞蠶脂肪體及其他組織樣品在研缽中加入液氮磨碎，按照Trizol試劑說明書提取。提取后總RNA利用微量核酸定量儀(NanoDrop 1000 Spectrophotometer)檢測RNA的純度和濃度。

1.3 ApSeptin基因的擴增

根據(jù)柞蠶cDNA文庫測序獲得的柞蠶ApSeptin基因部分片段的序列信息，利用Primer 5軟件設(shè)計ApSeptin基因特異的3′-RACE和5′-RACE引物(表1)。根據(jù)TaKaRa公司產(chǎn)品5′-Full RACE Kit和3′-Full RACE Core按照說明書分別制備第一鏈cDNA用于擴增ApSeptin3′端和5′端序列。5′-RACE PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s, 62 ℃退火40 s； 72 ℃延伸120 s，共34個循環(huán)，接著72 ℃延伸10 min。3′-RACE PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s，共34個循環(huán); 72 ℃再延伸10 min。RACE PCR擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段切膠回收后與pMD19-T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將ApSeptin基因的5′-RACE、中間部分序列以及3′-RACE的cDNA序列提交DNAStar軟件進行拼接，拼接成一個完整的序列，然后設(shè)計引物對拼接后的序列進行PCR驗證。

1.4 ApSeptin序列分析

利用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)尋找開放閱讀框(ORF)，并將其翻譯成氨基酸序列。采用SignalP3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測信號肽序列。利用在線BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)尋找并下載ApSeptin同源序列。蛋白質(zhì)分子量和等電點預(yù)測都在Expasy (http://web.expasy.org/compute_pi/)分析。利用Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多重序列比對，由MEGA 4.1軟件以鄰近法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[9]。

1.5 ApSeptin基因在柞蠶不同組織的表達分析

分別取5齡第3天的柞蠶幼蟲的各個組織(表皮、絲腺、脂肪體、中腸、馬氏管和血細胞)，按照Trizol法提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進行實時定量PCR，檢測ApSeptin基因在柞蠶不同組織的表達情況。

將ApSeptin序列提交Primer3軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在線設(shè)計實時定量PCR引物qApSeptin-SP和qApSeptin-AP(表1)。同時，設(shè)計柞蠶18S內(nèi)參基因的實時定量PCR引物qAp18S-SP和qAp18S-AP(表1)。分別取1 μg柞蠶各組織總RNA，加入無RNase的DNase在37 ℃處理30 min，以去除可能污染的基因組DNA。接著利用PrimeScriptTMMaster Mix進行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA用于定量PCR模板。反轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置為37 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 s, 接著4 ℃保存?zhèn)溆?。實時定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，10 μm 引物各1 μL，cDNA模板1 μL(20 ng)，滅菌蒸餾水7 μL。實時定量PCR反應(yīng)程序為：95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40個循環(huán)。對樣品進行了10倍梯度稀釋測得ApSeptin基因引物和內(nèi)參基因18S引物擴增效率。實時PCR設(shè)置溶解曲線分析，以查看是否為單一的擴增產(chǎn)物。利用2-ΔΔCt計算[10]檢測ApSeptinmRNA的相對表達量，以柞蠶18S rRNA基因mRNA的表達量做內(nèi)參進行歸一化處理[11]。每個樣品至少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)表示為mRNA相對表達量(平均值±標準差)。

表1 研究中所用到的引物

注：下劃線表示酶切位點。

1.6 ApSeptin基因的原核表達

圖1 柞蠶ApSeptin基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig 1 cDNA and deduced amino acid sequence of ApSeptin gene in A. pernyi注：啟動子ATG和終止子TAA加粗；終止信號用雙劃線標出。

圖2 柞蠶ApSeptin的結(jié)構(gòu)域分析Fig 2 Conserved domain analysis of ApSeptin

以柞蠶脂肪體cDNA為模板，設(shè)計表達引物ApSeptin-SP和ApSeptin-AP(兩端分別引入BamH I和XhoI酶切位點)，見表1，采用PCR擴增ApSeptin蛋白核苷酸序列，對PCR目的產(chǎn)物進行切膠回收。PCR回收產(chǎn)物和pET28a表達載體質(zhì)粒分別進行BamH I和XhoI雙酶切，后利用T4 DNA ligase將酶切后的目的PCR片段與同樣酶切的pET-28a載體相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTrans 5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后挑取陽性克隆進行菌落PCR驗證，并且對重組質(zhì)粒進行序列測定，以驗證插入是否正確以及是否有突變。將插入序列正確且無突變無移碼的重組表達載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，在含50 μg/mL卡那霉素(Kanamycin)的LB培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)到OD600=0.6時，加入不同濃度IPTG (0.2～1 mM)誘導(dǎo)表達，此后培養(yǎng)溫度調(diào)整為30 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后收集菌液。同時設(shè)置空表達載體(pET-28a)及不加IPTG的重組質(zhì)粒菌液作為對照。菌液超聲裂解后用12% SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApSeptin基因克隆與序列分析

通過5′-RACE和3′-RACE PCR都獲得了單一的條帶，經(jīng)過測序后和先前獲得的部分序列拼接得到了1904 bp的ApSeptincDNA全長，該序列包含1137 bp的開放閱讀框(ORF)，含160 bp 5′非編碼區(qū)和607 bp 3′非編碼區(qū)，其中開放閱讀框編碼378個氨基酸(圖1)。預(yù)測該蛋白分子質(zhì)量為43.31 kD，理論等電點為5.64。經(jīng)SignalP 3.0在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)ApSeptin沒有信號肽，為非分泌型蛋白。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)ApSeptin屬于Ras-like GTPase超家族，含有5個保守的基序(G1、G2、G3、G4、G5)(圖2)。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)柞蠶與家蠶(Bombyxmori)、黑脈金斑蝶(Danausplexippus)聚為一類，同源性最高，其次為佛羅里達弓背蟻(Camponotusfloridanus)、切葉蟻(Acromyrmexechinatior)和行軍蟻(Cerapachysbiroi)，而與果蠅(Drosophilamelanogaster)、酵母(Saccharomycescerevisiae)及人(Homosapiens)等同源性較低(圖3)。通過與幾個昆蟲septin多重序列比對發(fā)現(xiàn)，柞蠶ApSeptin與黑脈金斑蝶(D.plexippus)相似性最高(94.6%)，其次是家蠶(B.mori)(93.4%)，與佛羅里達弓背蟻(C.floridanus)、切葉蟻(A.echinatior)和行軍蟻(C.biroi)的相似性分別為82.7%、83.6%和83.8%(圖4)。并且發(fā)現(xiàn)昆蟲septin蛋白在N端和C端差異大，而在中間部分保守，相似性高(圖4)。

圖4 柞蠶ApSeptin與幾種昆蟲septin序列比對

圖3 不同物種septin的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

Bombyxmoriseptin (BmSept, NP_001040346),Danausplexippusseptin (DpSept, EHJ79093),Cerapachysbiroiseptin1 (CbSept1, EZA51439),Acromyrmexechinatiorseptin1(AeSept1, EGI63223),Camponotusfloridanusseptin1(CfSeptin1, EFN67706),Drosophilamelanogasterseptin(DmPnut, gi︱730352;DmSept1, gi︱17647925;DmSept2, gi︱17738071;DmSept4, gi︱24642597;DmSept5, gi︱21356243)，Caenorhabditiselegansseptin(CeUnc59, gi︱17509405; CeUnc61, gi︱32566810),Saccharomycescerevisiaeseptin(ScCdc3, gi︱6323346; ScCdc10, gi︱6319847; ScCdc11, gi︱6322536; ScCdc12, gi︱6321899; ScShs1, gi︱6319976; ScSpr28, gi︱6320424; ScSpr3, gi︱6321496),Homosapiensseptin(HsSept1, gi︱16604248; HsSept2, gi︱4758158; HsSept3, gi︱22035572; HsSept4, gi︱4758942; HsSept5, gi︱9945439; HsSept6, gi︱22035577; HsSept7, gi︱4502695; HsSept8, gi︱41147049; HsSept9, gi︱6683817; HsSept10, gi︱8088518; HsSept11, gi︱8922712; HsSept12, gi︱23242699; HsSept13, gi︱113418512).

2.2 ApSeptin基因在柞蠶幼蟲組織的表達分布

通過實時定量PCR檢測柞蠶5齡第3天幼蟲不同組織ApSeptin基因的表達水平，10倍梯度稀釋測得ApSeptin基因引物和內(nèi)參基因18S引物擴增效率分別為94.21%和93.43%，兩對引物熔解曲線都只有對應(yīng)的單峰，沒有出現(xiàn)二聚體雜峰，符合定量PCR要求。定量PCR結(jié)果表明該基因在柞蠶5齡第3天幼蟲的血細胞中表達量最高，其次是表皮，而在馬氏管、脂肪體、中腸和絲腺中表達量相對較低(圖5)。

圖5 ApSeptin基因在柞蠶5齡幼蟲組織的表達水平

2.3 ApSeptin的原核表達

經(jīng)測序分析，重組質(zhì)粒pET28a-ApSeptin構(gòu)建成功，插入序列方向正確，無堿基突變，并且目的基因的閱讀框與表達載體的閱讀框一致。pET28a-ApSeptin轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)(0.2～1.0 mM)下，在分子量為48 kD處有一條誘導(dǎo)表達條帶，而空載體及未誘導(dǎo)的菌未出現(xiàn)目的條帶，表明重組ApSeptin在大腸桿菌中表達成功，并且在0.6 mM IPTG時ApSeptin表達量最高(圖6)。

圖6 柞蠶ApSeptin原核表達

M—標準蛋白； 1—空表達載體； 2—未誘導(dǎo)對照； 3—0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)； 4—0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)； 5—0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)； 6—0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)； 7—1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)。

3 討論

Septin蛋白是繼微管蛋白、微絲蛋白和中間纖維蛋白之后第4種細胞骨架成分，并在細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞分裂周期調(diào)控及凋亡等生理過程中發(fā)揮了重要的作用[12]。關(guān)于septin的功能研究主要集中在人類及酵母中，而在昆蟲中研究較少，且主要集中在果蠅中。果蠅中有5個septin被鑒定，被證實參與了細胞質(zhì)分裂以及分裂末期卵裂溝的遷移過程，并且果蠅septin蛋白之間形成同源二聚體復(fù)合物具有結(jié)合和水解GTP的活性[3, 6]。近些年來的研究結(jié)果表明，果蠅中septin2突變的雄性是半不育的，并且septin2和septin5雙突變導(dǎo)致果蠅蛹致死[13]。本研究所克隆的柞蠶ApSeptin與果蠅septin的同源性不高，沒有聚為一類，而與家蠶及黑脈金斑蝶相似性高而聚為一類。然而家蠶及黑脈金斑蝶septin的功能還沒有研究，目前還不能根據(jù)果蠅septin功能預(yù)測柞蠶ApSeptin的功能，還需要進一步對其功能進行研究。

定量PCR結(jié)果表明柞蠶ApSeptin在血細胞及表皮中表達量高，而在其他組織中相對較低。根據(jù)家蠶基因芯片結(jié)果(芯片號為sw14493)發(fā)現(xiàn)家蠶septin在血細胞中表達量最高，而在睪丸及卵巢中表達量也較高[14]。昆蟲血細胞和表皮是主要的免疫器官，在應(yīng)對外源病原物的入侵中發(fā)揮了主要作用。柞蠶ApSeptin在血細胞及表皮中表達量高暗示其可能在柞蠶先天免疫中發(fā)揮作用，但還需要進一步的研究證實。搜索家蠶EST數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)家蠶septin在感染BmNPV的細胞系中檢測到，而在正常細胞系中沒有發(fā)現(xiàn)，這也預(yù)測家蠶septin可能參與了家蠶的免疫。人septin 2、6、8、10和11在巨噬細胞中大量表達，并且基因敲除septin2或septin11減少吞噬體形成和免疫球蛋白包被的珠子的吸收[15]。在人類感染的發(fā)生以及病原微生物與人類相互作用的過程中，septin蛋白可能參與了人類感染過程[5]。最新研究揭示了人septin9基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，抑制septin9基因的表達可有效抑制人肝癌HepG2細胞的增殖,并對細胞凋亡有明顯的促進作用[16]。通過腫瘤藥物敏感試驗選取化療高敏感性和低敏感性大B細胞淋巴瘤組織，蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究后發(fā)現(xiàn)septin 9作為大B細胞淋巴瘤化療敏感性相關(guān)標志物[17]。并且發(fā)現(xiàn)在44.3%的肺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有septin 9啟動子甲基化的現(xiàn)象，這對肺癌的早期診斷很有幫助[18]。

人類Septin蛋白家族與疾病的關(guān)系進行了大量研究，已證實septin家族與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染及男性不育癥等疾病發(fā)生相關(guān)[3]。柞蠶由于具有個體大，飼養(yǎng)容易，生長周期短等特點，近期柞蠶基因組測序已完成，可以開發(fā)其成為研究人類生理、疾病、遺傳和開發(fā)新型藥物的優(yōu)良模式動物。本研究克隆了柞蠶septin基因全長序列，進行了生物信息學(xué)分析，并研究了組織表達分布及原核表達，也探討了柞蠶septin可能存在的生物學(xué)功能，為今后研究柞蠶及其他昆蟲septin功能，探索以septin基因為切入點建立研究人類疾病與藥物篩選的柞蠶病理學(xué)模型提供理論基礎(chǔ)。

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