張 哲， 李同明， 曾勇慶， 陳 偉， 徐正剛， 楊 云， 房國鋒， 王守棟， 楚青惠

(山東農業(yè)大學動物科技學院 動物遺傳育種學實驗室， 山東 泰安 271018)

近年來豬肉品質受到消費者和生產者的廣泛重視，生產優(yōu)質高檔豬肉已經成為生產者追求的目標，其中肌內脂肪含量與抗氧化性能是影響豬肉品質的重要性狀。錢源等克隆豬磷酸酪氨酸互作結構域1(phosphotyrosine interaction domain containing1,PID1)基因，分析其表達與肌內脂肪的含量存在正相關[1-2]。楊倫等構建靶向小鼠RNA干擾沉默PID1基因表達載體，進一步揭示PID1基因影響豬的肌內脂肪沉積[3]。銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是超氧化物歧化酶(SODs)的一類，能轉移性的清除超氧陰離子自由基，抑制脂質氧化反應進行。2010年杜金芳等對豬CuZnSOD基因克隆表達，分析其在多種組織中表達，其表達顯著提高商品豬的抗氧化性能，改善商品豬的肉質[4]。本實驗室成功構建PID1和CuZnSOD真核表達載體，在真核細胞中成功表達，通過精子載體法獲得的轉基因兔，經性能測定肌內脂肪含量與肉質抗氧化性能顯著提高[5-6]。日常屠宰后肌內脂肪含量高的豬肉極易氧化，影響了豬肉品質，而豬肉抗氧化性能的提高正好解決此問題。目前研究也著力于對PID1與CuZnSOD基因的單獨研究。本研究構建PID1與CuZnSOD基因共表達載體，不僅提高了轉基因效率，同時表達兩種內源基因，而且在獲得高肌內脂肪含量豬肉品質的同時，提高了豬肉的抗氧化性能，為進一步制備肌內脂肪顯著提高并兼?zhèn)涓呖寡趸阅艿霓D基因豬等育種新材料奠定基礎。

多基因共表達技術在生物醫(yī)藥和農業(yè)研究中占有重要位置，多順反子載體構建以其表達高效而被廣泛應用[7]。構建多順反子載體常用方法：多啟動子表達載體、mRNA剪接、融合基因表達、內部核糖體進入位點(IRES)、 2A剪切。其中2A肽介導的多順反子載體已被證明是同時多基因表達的優(yōu)選[8]。2A肽被稱為“順式作用水解酶元素”(CHYSEL)，屬小核糖核酸病毒[9]。2A肽調控“核糖體跳過”，在保守區(qū)2A脯氨酸和2B甘氨酸之間發(fā)生斷裂，完成多蛋白獨立表達共翻譯過程[10]。目前研究已經證實2A介導多轉基因的共表達可行性[11-12]，其介導多因素共同誘導多能干細胞產生獲得巨大成功[13-14]。在哺乳動物上已經證實2A肽介導多個外源熒光報告基因共表達，但在轉與動物性狀相關聯的內源基因的應用研究為空白。本研究利用2A肽同時介導與肉質性狀關聯的內源基因PID1基因與CuZnSOD基因，在細胞水平上證實雙基因蛋白表達高效獨立，提高了轉基因效率，為應用于轉多基因育種新材料的制備在分子水平上奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

萊蕪豬耳組織樣品，限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、T4連接酶等分子試劑購自TaKaRa公司。DNA純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生物科技有限公司?？蛰d體pIRES2-AcGFP1(Clontech)，轉染試劑X-tremeGENE HP (Roche)，DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。大腸桿菌DH5α與PK15細胞系均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體構建

取100 mg萊蕪豬耳組織樣品使用Trizol法提取總RNA，所得RNA利用核酸蛋白測定儀進行濃度及純度檢測，采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證完整性，分裝后置于超低溫冰箱中-80 ℃保存。取耳組織RNA 2 μL，按PrimeScriptTM RT-PCR (TaKaRa)試劑盒進行，去除RNA樣品中殘留的基因組DNA，反轉錄反應合成cDNA。

根據NCBI基因數據庫中豬PID1基因與CuZnSOD基因序列，設計合適的引物。2A肽接頭經上海生工合成并克隆于PUC57載體上。2A序列: CCGGAATTCGGCAGTGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAGTCGAC。PCR擴增體系：PID1/CuZnSOD1 μL，10×Taq Buffer 2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，DNA聚合酶0.5 μL，P1/P2，S1/S2 (10 μmol/mL) 1 μL，滅菌雙蒸水15.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃補延伸10 min。

PCR產物經DNA純化試劑盒純化，用BglII/EcoR I雙酶切CuZnSOD，并同時酶切空載體pIRES2-acGFP1，對酶切產物進行純化回收后用T4連接酶連接。將連接產物轉化到大腸桿菌里，用卡那抗性的培養(yǎng)平板均勻涂板，37℃恒溫培養(yǎng)進行抗性篩選。提取陽性克隆質粒，利用酶切與測序鑒定得到質粒pIRES2-CuZnSOD。用SalI/HindIII雙酶切P1/P2擴增的PID1產物，亞克隆至質粒PUC57-2A，克隆轉化得到質粒PUC57-2A-PID1。質粒PUC57-2A-PID1經EcoR I/SacII雙酶切，純化回收片段2A-PID1，克隆入質粒pIRES2-CuZnSOD中，轉化后得到pIRES2-CuZnSOD-PID1載體。

表1 CuZnSOD基因與PID1基因引物設計

1.2.2 PK15細胞培養(yǎng)與轉染

PK15細胞用完全培養(yǎng)液(DMEM-F12+10% FBS)，在37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將處于對數生長期的細胞以1×105密度接種于6孔板，待細胞生長至70%～90%密度后進行細胞轉染。將構建pIRES2-CuZnSOD-PID1載體、空載體轉染到細胞中，每組設3個重復。每孔按0.8 μg質粒、 2 μL脂質體加樣。培養(yǎng)48 h后，觀察熒光拍照后收集細胞。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達

向每孔細胞中加入1 mL Trizol提取總RNA，測定其濃度與純度，按PrimeScriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa)說明書合成cDNA。采用SYBR Green染料法，以GAPDH為內參基因，分析PID1基因與CuZnSOD基因表達量。反應體系為：P3/P4，S3/S4 (10 μmol/mL)各0.5 μL，2 μL cDNA，12.5 μL SYBR Green，0.5 μL Plus Solution，補ddH2O至25 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。檢測每個待測樣品設置3個重復， 2-△△t的方法計算基因的表達水平。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達

將構建pIRES2-CuZnSOD-PID1載體、空載體轉染至細胞中，每組設3個重復，以轉染空載體細胞為陰性對照，未轉染的細胞為空白對照。收集轉染48 h細胞至1.5 mL離心管中，加入細胞裂解液，收集細胞總蛋白。再進行電泳分離、轉膜、封閉、I抗及II抗孵育后，曝光洗片，用Image J軟件分析灰度值[6]，應用統計軟件分析蛋白表達量。

1.2.5 數據分析

各組表達數據表示為平均值±標準誤，計算各基因相對表達量，應用SAS 8.2軟件統計分析，以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增PID1基因與CuZnSOD基因結果

以合成的cDNA為模板，擴增PID1基因與CuZnSOD基因編碼區(qū)，大小分別為654 bp與462 bp，經瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR產物條帶大小與預期相同且無雜帶，如圖1所示。

圖1 PCR擴增PID1基因與CuZnSOD基因CDS區(qū)

M—2000 bp; 1—CuZnSOD; 2—PID1。

2.2 載體pIRES2-CuZnSOD-PID1構建

構建的pIRES2-CuZnSOD-PID1載體分別經BglII/EcoR I、SalI/SacII雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，片段大小與PID1基因與CuZnSOD基因相一致，如圖2所示。對酶切鑒定正確的重組載體，進行克隆轉化測序。測序結果證實插入的基因堿基序列與GenBank中的PID1、CuZnSOD、2A序列完全一致，表明重組表達載體構建成功。構建成功的pIRES2-CuZnSOD-PID1重組質粒圖譜如圖3所示。

圖2 重組載體pIRES2-CuZnSOD-PID1酶切鑒定結果

M—2000 bp; 1—雙酶切產物PID1; 2—雙酶切產物CuZnSOD; 3—單酶切產物。

圖3 構建成功的重組質粒簡圖

2.3 重組質粒轉染PK15細胞

將重組質粒按X-tremeGENE HP說明書轉染至PK15細胞，培養(yǎng)48 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。如圖4所示，pIRES2-CuZnSOD-PID1載體所攜帶的熒光蛋白基因在細胞內高效表達，其中(a)為轉染前在普通顯微鏡下拍到細胞照片；(b)為熒光顯微鏡下拍到熒光出現。

圖4 質粒pIRES2-CuZnSOD-PID1在PK15細胞中表達

2.4 轉染重組質粒細胞CuZnSOD基因與PID1基因定量表達

2.4.1 重組載體中CuZnSOD基因的表達

定量結果顯示(圖5)，載體轉染對CuZnSOD基因的表達量的差異顯著，具體表現為pIRES2-CuZnSOD-PID1載體>空白細胞>pIRES2-AcGFP1空載體。其中轉染pIRES2-CuZnSOD-PID1載體的CuZnSOD基因表達量(1.995±0.012)，明顯高于陰性對照組(0.937±0.037)與空白組(0.952±0.039)，差異顯著(P<0.05)。

圖5 轉染質粒48 h后CuZnSOD基因的mRNA表達量Fig 5 The mRNA levels of CuZnSOD gene of vectors transfected after 48 h

1—pIRES2-CuZnSOD-PID1; 2—pIRES2-AcGFP1; 3—空白。

圖6 轉染質粒48 h后PID1基因的mRNA表達量Fig 6 The mRNA levels of PID1 gene of vectors transfected after 48 h

1—pIRES2-CuZnSOD-PID1; 2—pIRES2-AcGFP1; 3—空白。

2.4.2 重組載體中PID1基因的表達

定量結果顯示(圖6)，載體轉染對PID1基因的表達量差異顯著，具體表現為pIRES2-CuZnSOD-PID1載體>空白細胞> pIRES2-AcGFP1空載體。其中轉染pIRES2-CuZnSOD-PID1載體的PID1基因表達量(11.382±0.424)明顯高于陰性對照組(1.002±0.046)與空白組(2.039±0.049)，差異顯著(P<0.05)。

2.5 轉染重組質粒細胞CuZnSOD蛋白與PID1蛋白表達

重組質粒轉染PK15細胞48 h后，Western blot檢測CuZnSOD蛋白與PID1蛋白表達量(圖7)，用Image J軟件分析比較條帶灰度值發(fā)現，陽性組的CuZnSOD蛋白與PID1蛋白表達量較陰性組和空白對照組有顯著提高(P<0.05)，見圖8和圖9，結果表明CuZnSOD蛋白與PID1蛋白得到穩(wěn)定有效表達。

圖7 轉染質粒48 h后CuZnSOD蛋白與PID1蛋白表達情況

1—pIRES2-CuZnSOD-PID1; 2—pIRES2-AcGFP1; 3—空白。

圖8 CuZnSOD蛋白的表達水平Fig 8 Expression levels of CuZnSOD protein

1—pIRES2-CuZnSOD-PID1; 2—pIRES2-AcGFP1; 3—空白。

圖9 PID1蛋白的表達水平Fig 9 Expression levels of PID1 protein

1—pIRES2-CuZnSOD-PID1; 2—pIRES2-AcGFP1; 3—空白。

3 討論

豬肌內脂肪(IMF)是影響豬肉品質重要的性狀之一，它是由多基因控制的性狀。研究發(fā)現，PID1基因表達與脂類代謝相關，且與肌內脂肪含量存在正相關，提示PID1基因影響肌內脂肪沉積表達[1-2]。張春梅[15]等研究發(fā)現，PID1基因過表達通過下調胰島素刺激的GLUT4的轉位而減少脂肪細胞的葡萄糖攝取率，降低對胰島素的敏感性，調節(jié)脂肪代謝。石元[16]等通過構建雙熒光素酶報告基因重組載體，分析CuZnSOD核心啟動子區(qū)的活性，揭示CuZnSOD影響抗氧化性能。因此，在控制瘦肉率與背膘厚的條件下，PID1基因表達提高肉質風味，同時CuZnSOD基因表達提高抗氧化水平，為生產優(yōu)質豬肉提供思路，為獲得分子育種材料提供分子依據。本研究成功構建PID1與CuZnSOD共表達載體，獨立表達兩基因，對于同時提高豬肌內脂肪含量和抗氧化性能，提高豬肉品質具有重要意義。

IRES是在單啟動子的控制下，實現多基因獨立共表達的常用方法[17]。然而，IRES因自身序列較大以及前后連接基因表達不平衡而存在缺陷[18-19]。2A肽自身具有裂解活性，平均長度短，而且相對平衡了上下游基因的表達，成為IRES介導表達很好的替代。有報道稱，增強型綠色熒光的表達蛋白(EGFP)在MGMT-2A-EGFP雙順反子載體比在IRES介導表達高約3倍[20]。2A肽介導共表達技術表現出廣泛的應用前景。Trichas等利用2A肽介導獲得紅色與綠色熒光蛋白共表達的轉基因小鼠，介導的基因已整合到染色體并獲得穩(wěn)定遺傳[21]。本研究利用2A肽高效共表達，構建內源雙基因共表達模型，構建的真核雙表達載體pIRES2-CuZnSOD-PID1在PK15細胞上驗證PID1基因與CuZnSOD基因分別穩(wěn)定有效表達。在細胞水平上證明2A肽介導PID1與CuZnSOD基因共表達載體成功構建，能夠完成哺乳動物內源雙基因共翻譯過程。

本文通過2A肽構建PID1與CuZnSOD內源雙基因載體，驗證在PK15真核細胞中重組載體成功獨立表達，研究結果在細胞水平上證實內源雙基因共表達，為同時表達PID1與CuZnSOD基因，改善肉質性狀提供方法支持，為進一步制備肌內脂肪顯著提高并兼?zhèn)涓呖寡趸阅艿霓D基因豬等育種新材料奠定分子基礎。

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