余言想， 魏 華， 陶賢繼, #， 何義亮，呂為群

1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳與育種中心， 上海 201306 2. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699 3. 上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 上海 200240

富勒烯(C60)是一種具有獨特物理化學(xué)性質(zhì)的納米材料，被廣泛應(yīng)用于藥物傳遞、有機(jī)磁體和能量轉(zhuǎn)化等方面[1-3]。隨著富勒烯的大量生產(chǎn)和使用，人們越來越關(guān)注富勒烯散失到環(huán)境中可能造成的生態(tài)毒性作用。C60納米顆粒通過各種途徑進(jìn)入水體，然后在水體中形成納米水穩(wěn)型C60(nC60)，對水生生物產(chǎn)生毒性，進(jìn)而影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)。

有關(guān)nC60對水生生物和水生生態(tài)系統(tǒng)造成毒性損傷的研究很多。例如，nC60對斜生柵藻的生長有抑制作用，96 h-EC50為13.1 mg·L-1，且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系[4]。nC60對大型溞等水生無脊椎動物產(chǎn)生急、慢性毒性及生殖毒性，對大型溞48 h-LC50為0.43 mg·L-1[5]。富勒烯誘導(dǎo)大口黑鱸腦部脂肪超氧化作用[6]、阻礙斑馬魚胚胎的發(fā)育，增強(qiáng)斑馬魚體內(nèi)的抗氧化性酶的活性(CAT、GSH-PX)，并抑制魚類生長[7]。以上研究主要集中于C60單獨對水生生物產(chǎn)生危害，但低劑量(低于0.1 mg·L-1)nC60與重金屬交互作用對水生生物產(chǎn)生風(fēng)險的報道卻很少。

nC60因具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，可以促進(jìn)環(huán)境中其他有毒物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[8]。有報道證明nC60對其他污染物有很強(qiáng)的吸附能力，因此可能改變他們運(yùn)輸中的動力學(xué)過程[9,10]。這些發(fā)現(xiàn)也使科學(xué)家越來越關(guān)注nC60如何影響其他污染物的毒性。有關(guān)富勒烯C60單獨的生物學(xué)影響的報道很多，但是水生生態(tài)系統(tǒng)中富勒烯與其他污染物混合后產(chǎn)生的毒性效應(yīng)的研究報道卻很少。

為了更好的了解nC60與其他污染物在水生生態(tài)系統(tǒng)中潛在的相互作用，本試驗研究了nC60存在下Zn2+和Cr6+對大型溞的毒性作用。選取大型溞為受試物主要是因為大型溞在水生食物鏈中扮演著不可或缺的角色，其本身對外界環(huán)境中的污染物很敏感[11-13]。同時本試驗是對納米顆粒在環(huán)境中的歸宿、運(yùn)輸和轉(zhuǎn)化研究的補(bǔ)充。盡管越來越多的科學(xué)家開始研究納米顆粒的聯(lián)合毒性作用，但目前大家對該領(lǐng)域了解甚少[14,15]。

鋅(Zn)與鉻(Cr)是兩種常見的重金屬元素。Zn作為一種痕量必需金屬元素，是體內(nèi)重要酶的輔基[16]。但過量的Zn2+積累在生物體內(nèi)會對生物造成毒性損傷。例如，高濃度的Zn2+抑制黃姑魚胚胎發(fā)育，降低受精卵的孵化率[17]；過量的Zn2+也會影響黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)的生長、成活、繁殖[18]。Cr是一種生物體必需的微量元素，是生物體正常生長發(fā)育和調(diào)節(jié)血糖的重要元素。但過量的Cr6+降低了斑馬魚體內(nèi)CAT活性[19]，它誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞凋亡和氧化損傷[20]。C60進(jìn)入水體后形成nC60顆粒[21]，目前已知易于與微量元素Cu2+發(fā)生聯(lián)合作用[22]。是否會與重金屬離子Zn2+和Cr6+發(fā)生聯(lián)合作用，目前尚不清楚。本文以大型溞為研究對象，研究nC60與兩種重金屬離子(Zn2+和Cr6+)聯(lián)合毒性效應(yīng)，為nC60與其他重金屬離子之間的聯(lián)合作用提供一定參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物：大型溞于2009年購自Carolina Biological Supply Company。按照美國EPA標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)。具體方法如下：將大型溞培養(yǎng)在含有2 000 mL的中等硬度水的三角錐瓶中，培養(yǎng)溫度為21±1℃，光周期12 h：12 h，溶解氧為6.5 mg·L-1以上，光照強(qiáng)度為3 000 Lx左右。每天定時添加斜生柵藻，藻類具體培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)[23]。

1.2 化學(xué)試劑

試劑：C60(≥99.9%)為升華法提純品，購自美國Materials Electronics Research Corporation。四氫呋喃和甲苯都是液相色譜純，購于Fisher Scientific公司。Zn2+和Cr6+的標(biāo)液(介質(zhì)為硝酸，濃度為1 g·L-1)，購于上海阿拉丁試劑公司，實驗開始前將原液(1 g·L-1)稀釋至1 mg·L-1備用。SOD酶測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。其他相關(guān)試劑均為分析純或者優(yōu)級純，購于上海國藥集團(tuán)。

1.3 試驗方法

1.3.1 nC60的制備

按照Fortner等[24]的方法制備nC60，具體步驟：稱量100 mg C60，溶解于4 L THF中，沖入氮氣去除上部氧氣，并用封口膠帶密封保存，在磁力攪拌器上攪拌24 h(避開強(qiáng)光)備用。以500 mL·min-1的速度，將250 mL純水迅速通過漏斗加入到250 mL C60飽和四氫呋喃(THF)溶液中并且不斷攪拌形成nC60，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Büchi Rotovap system)連續(xù)蒸餾3次用以去除里面的THF和THF衍生物。冷卻過夜形成穩(wěn)定平衡的溶液，用0.22 μm的醋酸纖維膜過濾后備用。為了進(jìn)一步去除THF和THF的衍生物，nC60溶液使用旋轉(zhuǎn)過濾杯 (YM 10 000 MW超濾膜)，連續(xù)更換10次溶劑(超純水)中的一半，加壓洗滌去除nC60水溶液中剩余溶劑里面99.5%以上的THF，使用GC-MS未檢測到THF及其衍生物的存在。用于試驗的nC60懸浮液的平均尺寸是98.0 nm(使用dynamic light scattering (DLS)測定)[5]。

1.3.2 nC60的無效應(yīng)最高濃度(NOEC)的確定

nC60對大型溞急性毒性試驗參照EPA 2024方法進(jìn)行，以確定最高NOEC。配制0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mg·L-1的nC60濃度組，每個濃度組設(shè)置3個平行，每個試驗平行組放置10只幼溞。每6 h觀察一次死亡情況，連續(xù)試驗48 h。計算48 h后nC60對大型溞的致死率。利用EPA Probit法[17]計算48 h半致死劑量濃度(LC50)和分析最大無觀察效應(yīng)濃度(NOEC)。最大NOEC數(shù)值用于接下來聯(lián)合毒性試驗。

1.3.3 nC60對重金屬急性毒性的影響

使用EPA 2024標(biāo)準(zhǔn)對大型溞進(jìn)行48 h急性毒性試驗，檢測nC60與重金屬聯(lián)合毒性作用。根據(jù)預(yù)實驗，Zn2+最終濃度分別為0、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mg·L-1；Cr6+最終濃度分別為0、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45和0.48 mg·L-1，所有實驗組設(shè)置3個平行。所有濃度組的最終體積為100 mL。 每組放10只24 h內(nèi)出生的幼體大型溞。實驗過程中，每隔6 h記錄一次大型溞的存活數(shù)，試驗時間為48 h。利用EPA Probit法分析實驗數(shù)據(jù)，計算Zn2+和Cr6+的48 h-LC50。

1.3.4 nC60對Zn2+、Cr6+在大型溞體內(nèi)積累的影響

根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果，使用中等硬度水分別配置nC60濃度為0.10 mg·L-1，Zn2+濃度為0.50 mg·L-1和Cr6+濃度為0.30 mg·L-1的試驗溶液，最終體積為1 000 mL。以中等硬度水作為對照。每瓶放入50只5日齡(未懷卵)的大型溞。分別在第0、10、20、30、60、120、180、720和1 440 min隨機(jī)取4只大型溞，用中等硬度水清洗大型溞3次(洗去吸附體表的重金屬)。吸干體外粘附的水分，用0.20 mL濃硝酸消解至肉眼不可見顆粒物，最后用去離子水定容至20 mL。Zn2+濃度由原子吸收光譜儀(GBC 932 plus)測定(測定波長為283.3 nm)。Cr6+濃度成分用原子吸收分光光度計(TAS 990，普析通用)測定(測定波長為357.9 nm)。

1.3.5 nC60促進(jìn)重金屬對大型溞體內(nèi)SOD酶活力的影響

酶活性試驗暴露濃度的設(shè)置與積累實驗相同，最終濃度為nC60為0.10 mg·L-1，Zn2+濃度為0.50 mg·L-1，Cr6+為0.30 mg·L-1。每瓶放入50只5日齡大型溞，分別在第0、10、20、30、60、120、180、720和1440 min連續(xù)隨機(jī)取樣4只，先用去離子水清洗幾分鐘，然后加入1 mL Tris-蔗糖緩沖液，冰浴條件下用玻璃勻漿器快速勻漿，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，于12 000 rpm下離心10 min，獲得的上清液(粗酶液)用于酶活性測定。蛋白含量、SOD酶活力采用南京建成生物研究所試劑盒測定。蛋白質(zhì)濃度根據(jù)吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線計算(y= 105.32x-3.99，(R2= 0.99))。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用EPA Probit法分別計算LC50。數(shù)據(jù)采用Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行作圖與分析，顯著性差異檢驗采用ANOVA方差分析，p< 0.05表示統(tǒng)計有顯著性差異

2 結(jié)果(Results)

2.1 nC60的最高無效應(yīng)濃度(NOEC)的確定

大型溞幼體死亡率隨nC60濃度的增加而增大(圖1)。48 h后，0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mg·L-1各濃度組大型溞的死亡率分別為0、0、10、20、40、50和70%。利用EPA Probit法計算nC60的48 h-LC50為0.47 mg·L-1，觀察出NOEC為0.10 mg·L-1。該結(jié)果與Tao等[5]的結(jié)果(LC50為0.43 mg·L-1)接近。據(jù)此，0.10 mg·L-1將作為本文后續(xù)所采用亞急性聯(lián)合毒性試驗中nC60的濃度。

2.2 nC60與Zn2+和Cr6+對大型溞的聯(lián)合毒性

大型溞的死亡率隨著Zn2+、Cr6+濃度的增加、暴露時間的延長不斷增大； nC60會增強(qiáng)Zn2+、Cr6+對大型溞的急性毒性(圖2、3)。Zn2+對大型溞的48 h-LC50為2.33 mg·L-1，95%置信限范圍為2.20～2.46 mg·L-1；而在有nC60存在下，Zn2+對大型溞的48 h-LC50為1.52 mg·L-1，置信區(qū)間為1.45～1.60 mg·L-1；無nC60時，Cr6+對大型溞的48 h-LC50為0.40 mg·L-1，95%置信限范圍為0.39～0.41 mg·L-1；有nC60時，Cr6+對大型溞的48 h-LC50為0.33 mg·L-1，置信區(qū)間為0.32～0.33 mg·L-1。由此可見nC60增強(qiáng)了Zn2+、Cr6+對大型溞的急性毒性作用(p< 0.05)。在0.10 mg·L-1nC60濃度下，大型溞在1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mg·L-1Zn2+的暴露下，24 h死亡率分別增加100%、50%、100%、100%、75%。在0.10 mg·L-1nC60濃度下，大型溞在0、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45、0.48 mg·L-1的Cr6+暴露下，24 h死亡率分別增加100%、50%、100%、100%、75%。除此之外，有nC60存在時，相同濃度的Zn2+、Cr6+大型溞出現(xiàn)死亡的時間較無nC60要短，而且大型溞出現(xiàn)死亡的時間隨著重金屬濃度的增加而縮短。

圖1 nC60對大型溞幼體死亡的影響Fig. 1 Concentration-dependent mortality of D. magna to nC60

圖2 nC60與Zn2+對大型溞的聯(lián)合毒性Fig. 2 The joint toxicity of nC60 and Zn2+ on D. magna

2.3 nC60促進(jìn)Zn2+和Cr6+在大型溞體內(nèi)的蓄積

不論有無nC60存在條件下，大型溞體內(nèi)Zn2+、Cr6+的濃度都隨著暴露時間延長而增大(圖4)。當(dāng)有nC60(濃度為0.10 mg·L-1)存在時，大型溞體內(nèi)的Zn2+、Cr6+的蓄積比無nC60時顯著增加(p< 0.05)。無nC60存在時，1 440 min Zn2+濃度達(dá)到最大值6.52 μg·g-1濕重；有nC60存在時，1 440 min Zn2+濃度達(dá)到最大值9.98 μg·g-1濕重。1 440 min后，在nC60促進(jìn)下，大型溞對Zn2+蓄積量增加53.06 %。nC60不存在時，1 440 min大型溞體內(nèi) Cr6+蓄積濃度達(dá)到最大值1.52 μg·g-1濕重；nC60存在時，1 440 min 大型溞體內(nèi)Cr6+蓄積濃度達(dá)到最大值3.01 μg·g-1濕重。nC60促進(jìn)了大型溞對Cr6+累積量增加98.02%。

生物富集系數(shù)計算見方程(1):

(1)

圖3 nC60與Cr6+聯(lián)合對大型溞毒性Fig. 3 The joint toxicity of nC60 and Cr6+ on D. magna

圖4 nC60促進(jìn)Zn2+ ,Cr6+大型溞體內(nèi)的積累. Fig. 4 nC60 enhanced the accumulation of Zn2+, Cr6+ in D.magna.

1 440 min后，有nC60存在時，Zn2+的生物累積系數(shù)為19.96，而無nC60存在時生物累積系數(shù)為13.04。有nC60存在時，1 440 min后Cr6+的生物累積系數(shù)為10，而無nC60時，1 440 min后Cr6+的生物累積系數(shù)為5.06。兩種重金屬的生物富集系數(shù)在有nC60存在時增大，結(jié)果表明，nC60存在使得Zn2+和Cr6+的蓄累量增加。無nC60時，大型溞對Zn2+的吸收速度大于對Cr6+的吸收速度，相同時間大型溞吸收Zn2+的量也大于Cr6+。nC60使得Zn2+和Cr6+在大型溞體內(nèi)蓄累量都有一定的增加，但相比Zn2+，nC60更能促進(jìn)在大型溞體內(nèi)的蓄積。

2.4 nC60與Zn2+和Cr6+對大型溞體內(nèi)SOD酶的聯(lián)合作用

對照組大型溞體內(nèi)SOD酶活性不隨著試驗時間的延長發(fā)生明顯的變化，而試驗各組SOD酶活性隨著暴露時間的延長增大(圖5)。其中，nC60和Zn2+同時存在時的SOD酶活性高于只有nC60存在或只有Zn2+存在時SOD酶活性(p< 0.05)，24 h SOD酶活性較對照組分別增加了18.75%、35.37% 和54.68%。nC60和Cr6+同時存在時，SOD酶活性高于只有nC60存在或只有Cr6+存在時SOD酶活性(p< 0.05)，24 h SOD酶活性分別比對照組增加了30.62%、43.63%和65.37%。由此可見，nC60和Zn2+、Cr6+同時存在時，體內(nèi)的產(chǎn)生的氧自由基最多，增強(qiáng)了大型溞體內(nèi)SOD酶的活性。除此之外，Cr6+對SOD酶活性的影響要強(qiáng)于Zn2+對SOD酶活性的影響，這種影響效果與有無nC60是一致的。

3 討論(Discussion)

3.1 nC60與Zn2+、Cr6+對大型溞的聯(lián)合毒性

本試驗研究結(jié)果表明，nC60在NOEC濃度下(0.10 mg·L-1)增加了Zn2+和Cr6+對大型溞的毒性。有關(guān)高濃度C60急性毒性的報道很多[5-7]，本試驗主要是研究NOEC濃度(對大型溞無明顯的致死效應(yīng))nC60與Zn2+、Cr6+對大型溞的毒性影響，旨在說明NOEC濃度nC60對重金屬毒性強(qiáng)弱的影響。先前的聯(lián)合作用研究也顯示C60納米顆粒增強(qiáng)其他有毒物質(zhì)的毒性。例如，Carmen等[26]研究了As與C60對斑馬魚肝臟的聯(lián)合作用，研究表明肝細(xì)胞在暴露于C60(1 mg·L-1)和As3+下，細(xì)胞內(nèi)已有的谷胱甘肽減少、脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，并且這種作用要強(qiáng)于只有As3+存在的條件。不同生物對C60敏感度不同，本試驗針對大型溞選取和Carmen不同的C60濃度進(jìn)行研究，但在有毒物質(zhì)毒性增強(qiáng)方面結(jié)果一致。Baun等研究發(fā)現(xiàn)nC60可以增加菲對藻、大型溞的毒性，其毒性分別增加了60%和1 000%[27]。對大型溞的毒性增加效果要強(qiáng)于本試驗中Zn2+、Cr6+對大型溞的毒性，這可能與nC60的濃度和與nC60的作用方式不同有關(guān)。以上都是關(guān)于C60加強(qiáng)其他有害物質(zhì)毒性方面的研究，但也有相關(guān)報道[28-30]顯示膠體可以降低重金屬的毒性，可能是這些膠體和重金屬的作用機(jī)制和nC60不同，nC60本身帶負(fù)電，容易和帶正電的重金屬結(jié)合，導(dǎo)致重金屬在生物體內(nèi)蓄積過量。所以，在有重金屬的環(huán)境中，特別是必需痕量重金屬的環(huán)境中，評價納米顆粒的毒性時，C60的載體功能是一個應(yīng)該考慮的重要因素。

圖5 nC60與Zn2+ ,Cr6+對大型溞體內(nèi)SOD酶活力的影響Fig. 5 nC60 and Zn2+, Cr6+ affect SOD in D. magna.

3.2 nC60促進(jìn)Zn2+、Cr6+在大型溞體內(nèi)的積累

重金屬積累試驗結(jié)果表明，nC60促進(jìn)兩種重金屬在大型溞體內(nèi)的積累。C60是疏水性的化合物，能夠積累在生物體內(nèi)[31]。C60本身帶負(fù)電很容易和帶正電的Cu2+結(jié)合，結(jié)合后共同積累在大型溞體內(nèi)[22]。早期研究結(jié)果證明nC60對疏水性有機(jī)污染物有很強(qiáng)的吸附性能[32]，顯著增強(qiáng)多氯聯(lián)苯和菲的遷移能力，重金屬和有機(jī)物與nC60的作用方式不同，但最終的效果都是增加了這些物質(zhì)的積累；nC60增加As3+在斑馬魚細(xì)胞中的積累[26]，造成斑馬魚的氧化損傷；nC60增加Cu2+在大型溞體內(nèi)的積累，增加Cu2+對大型溞毒性[22]。本試驗結(jié)果和以上研究相同，當(dāng)nC60吸附Zn2+和Cr6+之后，其在溶液中的穩(wěn)定性減低并聚合形成比原來大的顆粒，從而被大型溞攝取，積累在體內(nèi)。這種積累增大重金屬的毒性，產(chǎn)生毒性增強(qiáng)的效果。生物累積假說指出，生物累積不僅受化學(xué)物質(zhì)本身性質(zhì)和生物種類的影響，而且受到水體外界環(huán)境的影響。例如，水體硬度、溫度、pH等。本試驗選取的水體環(huán)境是大型溞適宜生活環(huán)境，并未對外界因素對nC60增加Zn2+和Cr6+在大型溞體內(nèi)的積累做出研究，以后的工作中將加強(qiáng)對該方面的研究。除此之外，本文對于nC60通過何種途徑增加有毒物質(zhì)在生物體內(nèi)積累未做出解釋，食物鏈的傳遞可能導(dǎo)致nC60伴隨著有毒物質(zhì)的積累，但這方面的研究尚不足，需要更進(jìn)一步的研究。

3.3 nC60與Zn2+、Cr6+對大型溞體內(nèi)SOD酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種普遍存在于動植物體內(nèi)的金屬酶，可以清除體內(nèi)氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受活性氧自由基(ROS)的損傷[33]。對照組SOD酶活性沒有發(fā)生明顯的變化，各試驗組酶活性增大，并且只存在nC60或只存在重金屬離子時對酶活性的誘導(dǎo)程度要遠(yuǎn)小于兩者同時存在的情況。這與沈杰[34]研究富勒烯衍生物對PC細(xì)胞氧化性損傷的結(jié)果相同，富勒烯誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，激發(fā)機(jī)體防御系統(tǒng)產(chǎn)生SOD酶，解除ROS對細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。但這與相關(guān)報道[35]研究的富勒烯及其衍生物抑制酶活性的結(jié)果不同，結(jié)果顯示SOD酶活性受到抑制，對細(xì)胞造成氧化損傷。這可能是所選取的nC60濃度不同和nC60制備方法不同所造成。本試驗nC60、Zn2+和Cr6+所采用濃度都是NOEC濃度，屬于低濃度組，因此對酶的活性有誘導(dǎo)作用。兩種物質(zhì)相互作用時，這種誘導(dǎo)作用的強(qiáng)度增大，強(qiáng)于單一物質(zhì)對SOD酶的誘導(dǎo)作用，出現(xiàn)這種結(jié)果可能是兩種物質(zhì)對SOD酶活性影響的加和作用，也可能是兩者的協(xié)同作用，需要進(jìn)一步用試驗加以驗證。本實驗是NOEC濃度下對大型溞體內(nèi)SOD酶活性的影響，沒有對其他濃度的重金屬影響SOD酶活性做出評價；因缺乏分子生物學(xué)基礎(chǔ)，未能從分子方面影響機(jī)制做出研究，這些需要在以后的試驗中加以研究，得到更全面的結(jié)論。

基于本試驗的研究結(jié)果我們認(rèn)為重金屬的毒性評價不能只關(guān)注自身的毒性，還需考慮到環(huán)境中其他物質(zhì)與之發(fā)生的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)nC60加強(qiáng)了Zn2+和Cr6+對大型溞的毒性，同時nC60提高了大型溞對Zn2+和Cr6+的累積，大型溞在nC60與Zn2+和Cr6+作用后，SOD酶活性均得到增強(qiáng)。NOEC濃度下nC60與Zn2+和Cr6+作用后，對大型溞毒性作用存在一定的增強(qiáng)效果。

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