單國強，葉敏強,2，祝凌燕,*

1. 南開大學環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與防治重點實驗室,南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津300071 2. 連云港市環(huán)境監(jiān)測中心站，江蘇222001

四氯苯醌(TCBQ)及其還原態(tài)四氯氫醌(TCHQ)(二者結(jié)構式見圖1)是鹵代芳香性有機污染物如五氯酚、六氯苯等的肝臟代謝產(chǎn)物，具有極強的肝毒性及高致癌活性[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TCBQ還作為一種可能的消毒副產(chǎn)物在飲用水中廣泛存在[2]。TCHQ經(jīng)由四氯半醌自由基(TCSQ·)并進一步氧化為TCBQ的自氧化過程(autoxidation)可產(chǎn)生大量活性氧；氧化態(tài)的TCBQ通過Michael加成或親核取代反應，可與生命大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、DNA等)共價結(jié)合[3]。上述過程導致的氧化性損傷及異常共價結(jié)合物可部分解釋TCBQ或TCHQ造成細胞毒性及癌癥發(fā)生的原因[1,4-5]。

以表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG(化學結(jié)構式見圖1)為代表的茶多酚是茶葉中富含的活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，從茶葉中提取的EGCG具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等多種藥理作用[6]。日常飲用EGCG含量最高的綠茶，可有效降低五氯酚氧化脅迫引起的致癌風險，這可能與綠茶的活性成分EGCG有關[7]。由于其獨特多羥基酚結(jié)構，EGCG具有很強的抗氧化活性，可能對誘導氧化性損傷的活性氧或者氧化性物質(zhì)具有很好的清除作用[8]。

圖1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、四氯苯醌(TCBQ)和四氯氫醌(TCHQ)的結(jié)構式Fig. 1 The chemical structure of epigallocatechin gallate (EGCG), tetrachlorobenzoquinone (TCBQ) and tetrachlorohydroquinone (TCHQ)

氯代醌作為肝代謝產(chǎn)物或自來水消毒副產(chǎn)物，與日常飲茶時攝入的茶多酚類活性成分有可能共存于同一機體組織中。那么當二者共存時，茶多酚是否能解除或降低氯代醌的生物毒性呢？如果能，解毒機制是什么呢？針對上述問題，本研究選擇人肝癌細胞系HepG2細胞為生物模型，以EGCG和TCBQ為研究對象，開展氯代醌細胞毒性以及茶多酚解除其毒性的研究，以期更好地理解茶多酚物質(zhì)對鹵代芳香性有機污染物的抗氧化解毒作用機制。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 試 劑

((-)-Epigallocatechin gallate, EGCG, 99%)購自百靈威。四氯苯醌(2,3,5,6-tetrachlorobenzoquinone, TCBQ, 98%)和四氯氫醌(2,3,5,6-tetrachlorohydroquinone, TCHQ, 98%)購自Sigma-Aldrich (USA)。噻唑藍(Methylthiazoletetrazolium, MTT, 99%)購自Amresco (USA)。色譜純乙腈購于百靈威，水為Mill-Q超純水。其它試劑為國產(chǎn)分析純。細胞培養(yǎng)用磷酸鹽生理緩沖溶液(PBS，1 L)：NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO40.20 g。RPMI 1640改良型培養(yǎng)基購自于Gibco BRL (USA)。HepG2細胞系購自中國醫(yī)學科學院細胞中心。紫外可見吸收光譜及高效液相色譜分析采用的磷酸鹽緩沖溶液(PB，100 mmol·L-1，pH 7.4)：29.0142 g Na2HPO4和2.9649 g NaH2PO4溶解于1 L水中。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞存活率噻唑蘭(Methylthiazoletetrazolium, MTT)實驗

收集對數(shù)生長期HepG2細胞，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL細胞懸浮液，細胞數(shù)約為1.5×104個/孔。將96孔板置于5% CO2、37 ℃條件下孵育24 h，吸去原培養(yǎng)基，PBS洗滌。于各孔中加入含不同濃度的藥物培養(yǎng)基(不含胎牛血清)，藥物培養(yǎng)基配制時，先加入TCBQ或TCHQ，再加入EGCG。孵育2 h后，吸去含藥物培養(yǎng)基，PBS洗3次，再加入終濃度為0.5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜150 μL。使用酶標儀在波長570 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。所有的平行實驗重復3次，取其平均值，并計算標準偏差。

1.2.2 細胞內(nèi)活性氧(ROS)的測定

活性氧的測定參照文獻方法[9]，采用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)為檢測探針進行測定：待HepG2細胞長到孔底80%左右時，去除細胞培養(yǎng)基，加入200 μL DCFH-DA，終濃度10 μmol·L-1。在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA，然后加入含藥物的無血清培養(yǎng)基。在加入含藥培養(yǎng)基后開始計時，分別于0、30和60 min時間點，采用酶標儀測定熒光強度。全波長掃描多功能酶標儀(Thermo Electron Corporation, USA)操作條件為：激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.3 TCBQ/EGCG反應的紫外可見分光光度法(UV-vis)分析

將TCBQ和EGCG單獨或者混合于PB溶液(EGCG、TCBQ濃度分別為50、100 μmol·L-1)。在加藥并迅速混勻后開始計時，于0、30和60 min時間點分別取適量反應液，采用紫外可見分光光度計(Beckman Du 800 Spectrophotomet, USA)進行全波長掃描(200～600 nm)。

1.2.4 TCBQ/EGCG反應的高效液相色譜分析

采用高效液相色譜儀(HPLC 1200，Agilent, USA)測定EGCG、TCBQ、TCHQ、TCBQ+ EGCG和TCHQ+EGCG各反應溶液中指定物質(zhì)的濃度隨時間的變化。HPLC條件參考文獻方法[10]并做了適當?shù)恼{(diào)整：色譜柱：Supelcosil LC-18 (Sigma; 4.6 × 250 mm, 5 μm)，流動相為：11 mmol·L-1H3PO4溶液(40%)和乙腈(60%)，柱溫25 ℃，進樣20 μL，流速1 mL·min-1，檢測波長為292 nm。

1.2.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，應用origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖。兩組間均值比較采用單因素方差分析post hoc LSD檢驗，顯著性差異為p<0.05 (*)和p<0.01 (**)。統(tǒng)計分析用SPASS 17.0軟件完成。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 單獨TCBQ、TCHQ或EGCG的細胞毒性效應

在無血清培養(yǎng)基中，HepG2細胞暴露于TCBQ 2 h后，細胞存活率呈現(xiàn)濃度依賴性：當TCBQ為1、5和10 μmol·L-1時，與對照組相比，細胞存活率沒有明顯的變化。隨著TCBQ濃度增加，細胞存活率呈現(xiàn)明顯的逐降趨勢，當TCBQ濃度大于500 μmol·L-1時，細胞存活率低于5%(圖2A)。從圖2B可以看出，在無血清培養(yǎng)基中，HepG2細胞暴露于TCHQ 2 h后，細胞存活率也呈現(xiàn)濃度依賴性下降，但與TCBQ的有所區(qū)別：當TCHQ為1、5和10 μmol·L-1時，細胞存活率與對照組相比即逐漸降低，隨著TCHQ濃度增加，細胞存活率繼續(xù)降低。TCBQ對HepG2細胞的半數(shù)致死濃度LC50為104 μmol·L-1，而TCHQ的LC50為116 μmol·L-1，說明二者毒性效應差異不大，這可能是由于在孵育條件下TCHQ很容易經(jīng)自氧化過程轉(zhuǎn)變?yōu)門CBQ的緣故[11]。已有報道顯示，微生物通過還原酶將TCBQ還原為低毒性TCHQ，說明TCBQ的生物毒性要強于TCHQ[12-13]。單獨EGCG暴露組(圖2C)的研究結(jié)果表明，低濃度(<100 μmol·L-1)的EGCG不具有明顯的細胞毒性，但是在高濃度暴露組，細胞存活率與對照組相比則出現(xiàn)明顯下降，200、400 μmol·L-1濃度下細胞存活率分別為對照組的79%、67%。這與Chen等的報道結(jié)果一致[14]。EGCG是一種類似維生素C的活性物質(zhì)，同時具有抗氧化性(antioxidant)和促氧化性(pro-oxidant)作用, 低濃度EGCG呈現(xiàn)抗氧化作用，保護細胞免受氧化性損傷，而高濃度EGCG則主要表現(xiàn)為促氧化作用，對細胞呈現(xiàn)毒害效應[15]。

圖2 HepG2細胞單獨暴露于不同濃度TCBQ (A)、TCHQ (B)、 EGCG (C) 2 h后的細胞存活率：顯著性差異以Control (CT)組作對比檢驗Fig. 2 MTT assay in HepG2 cells exposed to TCBQ (A), TCHQ (B), EGCG (C) alone for 2 h: significantly different from the control (CT)

EGCG的多酚結(jié)構可以在生物體系中產(chǎn)生酚氧自由基及反應活性較高的醌類中間體，對生物分子進行共價修飾, 從而產(chǎn)生生物毒性[16]。因為人們在常規(guī)飲茶后血漿中EGCG等茶多酚活性物質(zhì)的濃度通常在μmol·L-1水平，遠遠低于其致毒濃度[17-18]，所以本研究不考慮高濃度EGCG的促氧化毒性作用。

2.2 TCBQ/EGCG或TCHQ/EGCG的聯(lián)合細胞毒性作用

圖3A所示為HepG2細胞同時暴露于200 μmol·L-1TCBQ和不同濃度EGCG溶液中2 h后的細胞存活率變化。不添加EGCG時，細胞存活率只有空白對照組的27.2%。但當添加5 μmol·L-1EGCG時，細胞存活率提升至32.3%，而且隨著添加EGCG量的增加，細胞存活率逐漸提高，當EGCG濃度達40 μmol·L-1時，細胞存活率提高近一倍，為46.8%。但是隨著EGCG濃度繼續(xù)增加，細胞存活率卻又呈下降趨勢，但仍高于TCBQ對照組。這說明低濃度的EGCG，對TCBQ造成的細胞毒性有一定的解毒作用，但隨著濃度的升高，解毒作用反而有所降低。圖3B的結(jié)果表明，10～320 μmol·L-1EGCG的加入對TCHQ造成的細胞毒性沒有顯著影響。這意味著EGCG對預先加入TCHQ導致的細胞毒性的抑制效應并不明顯。TCHQ在生理條件下極易自氧化，因此預先加入TCHQ的毒性主要是由于自氧化過程產(chǎn)生的ROS及TCBQ造成的[10-11]。研究顯示，通過抑制該自氧化過程，可以降低TCHQ的毒性效應[13,19-20]。

圖3 不同濃度EGCG和200 μmol·L-1 TCBQ (A)或者TCHQ (B) 共同暴露于HepG2細胞對細胞存活率的影響：Control (CT)組為空白對照; EGCG組為單獨的EGCG (160 (A)、320 (B) μmol·L-1)；顯著性差異以TCBQ或TCHQ單獨組作對比檢驗Fig. 3 MTT assay in HepG2 cells exposed to EGCG alone and co-exposed to EGCG and 200 μmol·L-1 TCBQ (A) or TCHQ for 2 h (B): for the joint group, significantly different from the individual TCBQ or TCHQ group

圖4顯示，單獨200 μmol·L-1TCBQ作用下，加藥后0 min的HepG2細胞內(nèi)的ROS水平為空白組的5.3倍，ROS產(chǎn)生量隨時間延長而增加，但增加不明顯。在細胞培養(yǎng)環(huán)境下，TCBQ單獨暴露組ROS水平升高可能源于TCBQ與生命物質(zhì)(如細胞膜蛋白、重要蛋白酶)的共價結(jié)合誘導產(chǎn)生，共價結(jié)合反應速度非常快，可以瞬時完成。不同濃度的EGCG和200 μmol·L-1TCBQ共同作用于細胞時，ROS的產(chǎn)生量相比TCBQ單獨組出現(xiàn)下降，并且隨著EGCG濃度的增加而下降趨勢愈明顯。40、80和160 μmol·L-1EGCG 與TCBQ共同作用下，加藥后0 min的ROS產(chǎn)生量分別為TCBQ單獨作用的94.1%、70.3%和43.4%；而且隨著作用時間的延長，TCBQ +EGCG共同作用下細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量盡管有少許增加，但仍然顯著低于單獨TCBQ組相同時間點的ROS水平。

2.3 EGCG對TCBQ誘導HepG2細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

然而，比較圖3A與圖4可發(fā)現(xiàn)，與TCBQ單獨組相比，添加40 μmol·L-1EGCG的聯(lián)合組，細胞存活率提高72%，細胞ROS水平下降卻不顯著。而添加80、160 μmol·L-1EGCG的聯(lián)合組，與TCBQ單獨組相比，細胞ROS水平下降明顯(分別是29.7%和56.6%)，細胞存活率卻低于添加40 μmol·L-1EGCG的聯(lián)合組，僅比TCBQ單獨組分別提高47%和23%。另外，單獨160 μmol·L-1EGCG暴露組的ROS水平低于空白對照組，但其細胞存活率卻為空白對照組的83.7%。以上結(jié)果表明EGCG清除TCBQ誘導產(chǎn)生的活性ROS，可能并不是EGCG抑制TCBQ細胞毒性的主要原因。

圖4 HepG2細胞暴露于不同濃度EGCG和200 μmol·L-1 TCBQ后的細胞ROS水平：單獨160 μmol·L-1 EGCG的顯著性差異以Control (CT)組作對比檢驗；不同濃度EGCG與TCBQ的聯(lián)合組的顯著性差異以不添加EGCG的TCBQ單獨組作對比檢驗Fig. 4 The ROS level in HepG2 cells which were exposed to EGCG alone and to EGCG with 200 μmol·L-1 TCBQ: for individual EGCG group, significantly different from the control (CT); for the joint group, significantly different from the individual TCBQ group

2.4 TCBQ與EGCG的相互作用

EGCG、TCBQ的單電子氧化還原電動勢分別是550 mV和250 mV[21-22]，由此推測二者共存時，它們之間可能發(fā)生直接的氧化還原反應。我們首先采用UV-vis光譜法來初步觀測二者之間的相互作用。圖5A顯示TCBQ(最大吸收波長為292 nm)在生理緩沖溶液中可以發(fā)生水解[23]。在細胞培養(yǎng)體系中，與自發(fā)的水解速率相比，TCBQ與生命大分子物質(zhì)的直接反應速率則要快得多，因此，本研究中忽略TCBQ水解的影響。圖5B表明單獨的EGCG(最大吸收波長為274 nm)在60 min內(nèi)一直比較穩(wěn)定，沒有發(fā)生顯著變化。圖5C顯示，EGCG與TCBQ混合后0 min時的TCBQ的最大吸收波長292 nm峰消失，并在320、450 nm處有新吸收峰出現(xiàn)，隨著反應時間的延長，這兩個吸收峰信號逐漸減弱，直至60 min幾乎完全消失。從文獻可知[10]，這兩個特征波長吸收峰極可能是TCHQ與四氯半醌自由基(TCSQ·)對應的特征吸收峰。也就是說，EGCG的加入，促使TCBQ還原轉(zhuǎn)化為TCHQ。此外，30 min時的UV-vis圖譜上還出現(xiàn)了278 nm左右的一個肩峰，該肩峰的吸光度60 min時更高(圖5C)。

圖5 在PB溶液中100 μmol·L-1 TCBQ和50 μmol·L-1 EGCG單獨或混合時的UV-vis譜圖Fig. 5 UV-vis spectra of the reaction solutions after TCBQ (100 μmol·L-1) or EGCG (50 μmol·L-1) were added individually or jointly into PB

為進一步研究TCBQ與EGCG的相互作用，我們采用HPLC對TCBQ與EGCG的反應產(chǎn)物進行了分離和鑒定。結(jié)果表明，TCBQ出峰時間為6.5 min(圖6)，加入EGCG后，TCBQ物質(zhì)的峰強度顯著下降，卻在保留時間4.2 min處檢測到TCHQ的峰，并在4.9 min處出現(xiàn)了一新產(chǎn)物峰(暫稱為C)。

圖6 在PB溶液中100 μmol·L-1 TCBQ和50 μmol·L-1 EGCG反應的HPLC色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograph of the reaction of 100 μmol·L-1 TCBQ and 50 μmol·L-1 EGCG in PB

TCBQ、TCHQ、TCBQ+EGCG以及TCHQ+EGCG(先加EGCG，后加TCHQ)四種反應體系在0～50 min內(nèi)的反應物或產(chǎn)物的變化見圖7。圖7A表明100 μmol·L-1TCBQ在PB緩沖液中緩慢發(fā)生水解，而圖7B進一步證實TCHQ單獨存在時可以迅速發(fā)生向TCBQ轉(zhuǎn)化的自氧化過程。在TCBQ和EGCG共存的混合反應溶液中，加藥后0 min的產(chǎn)物TCHQ/TCBQ比例為3:2(圖7C)；而單獨TCBQ暴露組中(圖7A)，加藥后0 min的產(chǎn)物 TCHQ/TCBQ比例為1:12；證實EGCG的確可促使TCBQ還原為TCHQ。圖7D 顯示先加入EGCG，后加入TCHQ，加藥后0 min 的TCHQ/TCBQ比例為6:1，10 min TCHQ 仍保持為原來的3/4；而單獨TCHQ組(圖7B)，因自氧化導致加藥后0 min 的TCHQ/TCBQ比例為5:2，10 min TCHQ 即減至原來的1/4。該結(jié)果說明EGCG可抑制TCHQ的自氧化。文獻報道顯示，維生素E、C及青霉胺可以通過延緩或者降低TCHQ的自氧化，從而保護生物體免受TCHQ自氧化的毒害[19-20,24]。由此推測，EGCG的存在，可能也通過抑制TCHQ的自氧化過程緩解其毒性。因此，低濃度的EGCG促使TCBQ轉(zhuǎn)化為TCHQ，降低了TCBQ的細胞外液濃度，同時抑制了TCHQ的自氧化，從而起到一定的細胞保護作用。另外，圖7C顯示加藥后0 min的溶液中出現(xiàn)產(chǎn)物C，并且隨著時間的延長，該產(chǎn)物的峰面積呈現(xiàn)遞增的趨勢，該產(chǎn)物的化學結(jié)構及其生物學意義還有待進一步研究。對于在80、160 μmol·L-1EGCG與TCBQ共存的聯(lián)合暴露組中，細胞存活率反而低于40 μmol·L-1EGCG與TCBQ的聯(lián)合組，其原因可能有兩點：1) 與高濃度EGCG自身毒性有關，因為同一批次實驗中單獨160 μmol·L-1EGCG的對照組，細胞存活率已降至83%左右；2) 可能與TCBQ的共存有關，因為在TCBQ被還原的同時，EGCG更多地轉(zhuǎn)化為可以導致蛋白質(zhì)毒性的酚氧自由基[25]。

綜上所述，低濃度的EGCG在一定程度上能保護細胞免受TCBQ的毒害作用。EGCG能降低TCBQ誘導的細胞內(nèi)ROS水平，但這不是主要的解毒機制。而該解毒過程可能與EGCG能加速TCBQ還原為TCHQ，同時抑制TCHQ的自氧化有關。由于EGCG是茶中的主要活性成分，因此常飲茶能在一定程度上緩解由TCBQ導致的生物毒性。

圖7 在PB溶液中100 μmol·L-1 TCBQ(或TCHQ) 和50 μmol·L-1 EGCG反應時各化合物濃度隨時間的變化Fig. 7 The reactions of TCBQ (or TCHQ) (100 μmol·L-1) and EGCG (50 μmol·L-1) in PB

致謝：感謝中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心朱本占研究員的幫助和大力支持。

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