張晉華,胡俊杰,李鵬飛,朱芷葳

(1.偏關(guān)縣農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，山西 偏關(guān) 036400；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

致病性大腸桿菌對人畜的感染，根據(jù)發(fā)病癥狀和機(jī)理可分為兩種類型：一種是腸道外感染，主要引起尿路感染、腹膜炎、結(jié)膜炎、腦膜炎、敗血癥等[1]；另一種是腸道內(nèi)感染，是大腸桿菌最主要的致病方式[2]。大量監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，抗生素的廣泛使用使細(xì)菌的耐藥性逐漸蔓延和加劇，世界各地都已報(bào)道分離的大腸桿菌存在普遍的高耐藥性，因此引起人們的高度重視[3～5]。源于雞、鴨、豬等的大腸桿菌都普遍存在多重耐藥性，且其耐藥性很多達(dá)90%以上[6,7]，嚴(yán)重影響了動(dòng)物的臨床治療效果，而且有研究表明食品動(dòng)物抗生素使用與人類細(xì)菌的耐藥性增加存在密切的關(guān)系[8,9]。本研究通過給家兔不同部位相同劑量感染致病性大腸桿菌，免疫結(jié)束2 w后心臟采血獲得免疫血清，通過雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測抗體效價(jià)，為人畜大腸桿菌感染的免疫提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

致病性大腸桿菌由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；家兔購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)30 d供試驗(yàn)用。

生理鹽水、瓊脂粉、無水乙醇、肉湯培養(yǎng)基均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)

選擇干凈飼養(yǎng)室，定時(shí)供給飼料，每日2～3次；飼料以豆莢為主，適量搭配菜葉、胡蘿卜；注意飼養(yǎng)室和兔籠衛(wèi)生，防止飼料污染引發(fā)疾病。

1.2.2 抗原制備

將致病性大腸桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)48 h；挑取少量菌株，溶于生理鹽水中，滴加少量0.5%甲醛，90℃水浴30 min；取滅活的大腸桿菌菌液，生理鹽水稀釋，紫外分光光度計(jì)600 nm下OD值為1，此時(shí)大腸桿菌濃度為109個(gè)·mL-1，即為試驗(yàn)用抗原。置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組免疫

將試驗(yàn)用家兔分為A、B、C 3組，每組3只，隔離飼養(yǎng)。A組通過耳緣靜脈注射，B組經(jīng)四肢及腹部皮下5點(diǎn)注射，C組為對照組。注射時(shí)間及劑量見表1。免疫期間觀察其健康狀況，若出現(xiàn)生病、死亡等現(xiàn)象，及時(shí)更換健康的家兔重新進(jìn)行免疫。

表1 免疫時(shí)間及劑量

1.2.4 采血及血清分離

免疫結(jié)束2 w后采用心臟采血法進(jìn)行采血。操作方法為：將家兔仰臥固定，在其第三肋間胸骨左緣3 mm處用注射器小心垂直刺入心臟(插入后不要左右擺動(dòng)針頭，防止傷及心肺)，迅速拉動(dòng)柱塞(縮短針頭在心臟內(nèi)的停留時(shí)間，防止血液凝固)，一次采血不超過20 mL；將血液分別收集到離心管中，靜置30 min，3000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，靜置15 min后，3000 r·min-1再離心15 min，吸取上清液。置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 雙向瓊脂擴(kuò)散測定抗體效價(jià)

稱取1 g瓊脂粉，加100 mL生理鹽水，煮沸溶解，配制成1%瓊脂凝膠，放于58～60℃水浴箱中，平衡溫度備用；將潔凈的載玻片水平置于桌面上，向其緩慢傾注配好的瓊脂液5 mL，使其形成1.5～2 mm厚的瓊脂板，室溫自然冷卻；用直徑為3 mm的打孔器，制作孔間距為5 mm的梅花板(圖1)，挑出孔內(nèi)瓊脂；在火焰上加熱瓊脂板，使其孔底邊緣的瓊脂熔化封底，以免造成滲漏或樣品污染。

取數(shù)支0.5 mL的離心管，各加入50 μL生理鹽水；取50 μL免疫血清加入1號管中，吸打使之與生理鹽水混勻，即制成為1∶2的稀釋血清；再從1號管中吸取1∶1稀釋血清50 μL加到2號管中，吸打混勻配為1∶4的稀釋血清，重復(fù)以上操作，獲得高倍比稀釋的血清；依次將A、B、C 3組的免疫血清進(jìn)行稀釋。

將抗原加入中心孔，倍比稀釋的免疫血清依次加入周圍孔，周邊第一個(gè)孔滴加生理鹽水，作空白對照，每孔加樣10 μL；將瓊脂板放入濕盒內(nèi)，于37℃溫箱中靜置，擴(kuò)散24～48 h，觀察結(jié)果。

1.2.6 評價(jià)方法

試驗(yàn)采用3次重復(fù)，結(jié)果以最大稀釋倍數(shù)下出現(xiàn)免疫沉淀線組作為最終抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)多次注射劑量優(yōu)化，確保試驗(yàn)中無家兔死亡。對3組家兔進(jìn)行采血、分離血清，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散24～48 h，結(jié)果見圖2、圖3。對擴(kuò)散圖進(jìn)行分析，記錄每組血清中出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋比例，即為所得抗體的效價(jià)。

各組家兔經(jīng)不同方法免疫后，A組抗體效價(jià)為1∶2048，B組為1∶128。注射過大腸桿菌的A、B組血清在瓊脂擴(kuò)散中出現(xiàn)沉淀線，未注射過大腸桿菌的對照組C組沒有出現(xiàn)沉淀線，說明免疫成功。

圖2 A組瓊脂擴(kuò)散結(jié)果Fig.2 The results of agar diffusion of group A

圖3 B組(Ⅰ、Ⅱ)和對照組(Ⅲ)瓊脂擴(kuò)散結(jié)果Fig.3 The result of agar diffusion of group B(Ⅰ,Ⅱ)and group C(Ⅲ)

3 討論

通常機(jī)體的免疫系統(tǒng)在受到外界抗原的刺激后發(fā)生的免疫應(yīng)答分為3個(gè)階段，即致敏階段、反應(yīng)階段和效應(yīng)階段。致敏階段是機(jī)體對抗原的識別和處理階段，該階段T細(xì)胞和B細(xì)胞被激活；在反應(yīng)階段激活的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分化和增殖，T細(xì)胞分化為淋巴母細(xì)胞，經(jīng)分化、增殖為致敏淋巴細(xì)胞，B細(xì)胞經(jīng)分化、增殖成為漿細(xì)胞；效應(yīng)階段是發(fā)生免疫功能的階段，當(dāng)致敏淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞再次受到相應(yīng)抗原刺激后，釋放出多種生物活性淋巴因子參與細(xì)胞免疫，漿細(xì)胞則合成分泌多種抗體，參與體液免疫[10]。本試驗(yàn)中采用耳緣靜脈注射和皮下多點(diǎn)注射的方法來免疫動(dòng)物，采用相同的注射時(shí)間、相同的注射劑量，結(jié)果差別卻很大。皮下多點(diǎn)注射方法相對較溫和，免疫的動(dòng)物不易死亡，但短時(shí)間內(nèi)所得抗體效價(jià)并不高。這可能是由于皮下注射時(shí)，抗原擴(kuò)散速度較慢，在皮下組織中會(huì)停留較長時(shí)間，造成部分抗原沒有及時(shí)加入免疫反應(yīng)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，這部分抗原在組織中可能會(huì)感染動(dòng)物的皮膚，使之發(fā)生一些病癥，引起一些環(huán)境微生物的感染，這些微生物將與目標(biāo)抗原競爭體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞，使目的抗原可活化使用的免疫活性細(xì)胞減少，致使抗體的產(chǎn)生量并不理想。采用耳緣靜脈注射方法免疫，反應(yīng)較為劇烈，但在較短時(shí)間內(nèi)可獲得高效價(jià)的抗體?？乖?jīng)靜脈注射入動(dòng)物體內(nèi)后，可迅速與血液中的免疫細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量抗體，提高血液中對應(yīng)抗體的效價(jià)；該方法由于反應(yīng)劇烈，高劑量的抗原可能會(huì)使試驗(yàn)動(dòng)物致病甚至死亡，需要掌握好注射抗原的劑量與時(shí)間。

研究表明，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮免疫作用要經(jīng)過一個(gè)潛伏期，細(xì)菌性抗原一般為5～7 d，合理的免疫次數(shù)和間隔時(shí)間，對高效價(jià)的抗體產(chǎn)生非常關(guān)鍵；初次注射抗原時(shí)，抗體產(chǎn)生速度較慢，效價(jià)較低，持續(xù)時(shí)間較短，但其特異性高；重復(fù)注射抗原出現(xiàn)再次反應(yīng)，抗體效價(jià)上升較快、持續(xù)時(shí)間較長；經(jīng)多次注射，可獲得較高效價(jià)的免疫血清，但抗體特異性有所降低[11]。對于不同種類的抗原，注射間隔時(shí)間也有所區(qū)別，本試驗(yàn)通過制定合理的方案，選擇在0、24、72、120 h注射抗原，在免疫結(jié)束2 w后分離免疫血清，對抗體效價(jià)的客觀評價(jià)具有重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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