田晶，梁麗，孟豪，郝赤，馬瑞燕

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)以前稱為玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)，屬于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotian)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Moniliales)、叢梗孢科(Moniliaceae)、棒束孢屬(Isaria)，分布廣泛，能寄生同翅目、半翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等多種有害昆蟲(chóng),是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌[1]。20世紀(jì)90年代以來(lái)國(guó)外就玫煙色棒束孢的生物學(xué)、分類、遺傳變異、代謝產(chǎn)物、致病性測(cè)定等方面進(jìn)行了大量研究，在歐洲玫煙色棒束孢已商品化且用于防治煙粉虱[2～6]。國(guó)內(nèi)的研究工作主要集中在玫煙色棒束孢菌株的生物學(xué)特性及致病性測(cè)定等方面，吳偉等對(duì)玫煙色棒束孢不同菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究[7～9]，黃振等測(cè)定了玫煙色棒束孢對(duì)煙粉虱、桃蚜等的致病力[10～12]。

2011年在山西省太谷縣溫室大棚中分離鑒定到一株玫煙色棒束孢菌株，命名為IF-1106，通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)證明該菌對(duì)煙粉虱等害蟲(chóng)有較高的致病力[13]，因此可用該生防菌防治害蟲(chóng)。李昌農(nóng)等[14]報(bào)道培養(yǎng)條件對(duì)菌株的產(chǎn)孢量及致病力均有較大影響，且產(chǎn)孢量是篩選優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)[13]。此外，不同菌株的生物學(xué)特性之間有所差異[7～9]。因此，了解影響該玫煙色棒束孢菌株菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的環(huán)境因子，是利用該菌防治害蟲(chóng)的基礎(chǔ)。

本文以菌落直徑和產(chǎn)孢量為指標(biāo)，對(duì)玫煙色棒束孢IF-1106菌株室內(nèi)平板培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基配方、溫度、pH、光照條件和通氣條件進(jìn)行了初步篩選，明確該菌株培養(yǎng)的最適條件，以期為該菌的大量生產(chǎn)提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步利用該菌進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玫煙色棒束孢IF-1106菌株，試管斜面保存于4℃冰箱中。使用時(shí)，取出活化，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.1 菌落生長(zhǎng)速率測(cè)定

挑取斜面菌種的分生孢子，接入已經(jīng)滅菌的0.1%的吐溫80溶液中，用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)整為1.0×107孢子·mL-1，制成孢子懸浮液。用滅菌的濾紙片(直徑6 mm)蘸取孢子懸浮液，置于每皿25 mL培養(yǎng)基的平板中心，25℃條件下黑暗培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)5次，從第3 d開(kāi)始每隔2 d定時(shí)、定向測(cè)量菌落直徑，共測(cè)5次，計(jì)算生長(zhǎng)速率(mm·d-1)，同時(shí)觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.2 產(chǎn)孢量的測(cè)定

在第5次測(cè)量菌落直徑后，用滅菌打孔器在菌落中心至邊緣1/2處打孔，分別打孔5處，且5處菌餅的位置在不同平板中基本一致，用0.1%的吐溫80打散，放在磁力攪拌器上攪拌30 min，用雙層擦鏡紙過(guò)濾后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3 培養(yǎng)條件設(shè)置

1.3.1 培養(yǎng)基配方

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L。

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA): 土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L。

薩氏葡萄糖培養(yǎng)基(SDA):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

薩氏葡萄糖酵母浸膏培養(yǎng)基(SDAY):蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂15 g，酵母粉2 g，蒸餾水1 L。

薩氏麥芽糖酵母浸膏培養(yǎng)基(SMAY):蛋白胨10 g，麥芽糖40 g，瓊脂15 g，酵母粉2 g，蒸餾水1 L。

察氏培養(yǎng)基(Czperk):NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 L。

菌株接種于以上各種培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中全黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理5次重復(fù)，各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定同1.2。

1.3.2 溫度

菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，分別于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的霉菌培養(yǎng)箱中全黑暗培養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)5次重復(fù)，各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定同1.2。

1.3.3 光周期

菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于25℃下設(shè)24 L、16 L/8 D、12 L/12 D、8 L/16 D、24 D 5個(gè)光周期培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定同1.2。

1.3.4 通氣

菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)。將接好菌的培養(yǎng)皿分別用Parafilm(美國(guó)，PM-996)封口膜(裁成3 cm的寬度)封口、家用保鮮膜(裁成3 cm的寬度)封口、不封口，共3個(gè)處理，每個(gè)處理5次重復(fù)，各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定同1.2。

1.3.5 初始pH

用NaOH和乳酸調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH值分別為5、6、7、8、9，然后接種于25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理5次重復(fù)，各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定同1.2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，均值差異顯著性通過(guò)Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析?；貧w方程用SPSS線性回歸分析得出，回歸方程斜率即為菌落生長(zhǎng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

玫煙色棒束孢在6種不同培養(yǎng)基上的菌落直徑(F=69.40; df=5,24; P<0.001)及產(chǎn)孢量(F=55.40; df=5,24; P<0.001)不同(表1)。在SMAY培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)與其他處理差異顯著，菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑最大，為36.9 mm，但該菌株的產(chǎn)孢量卻較低。玫煙色棒束孢在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量與其他處理差異顯著，產(chǎn)孢量最大，達(dá)1.91×107孢子·mL-1。

2.2 不同光照對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

在不同的光周期下，菌落直徑(F=127.1; df=4,20; P<0.001)及產(chǎn)孢量(F=5.832; df=4,20; P=0.003)有一定差異(表2)。24 h全光照條件下，菌落直徑最大，為48.8 mm；生長(zhǎng)速率最快，為4.627 mm·d-1。在全黑暗條件下，菌落的產(chǎn)孢量最大，為1.992×107孢子·mL-1。隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落直徑呈逐漸增大趨勢(shì)，但菌落的產(chǎn)孢量逐漸下降。

另外，在全光照條件下菌落較薄，絨毛狀菌絲較少，菌落較光滑，玫煙色較深；在光暗交替下，菌落有明顯的同心輪紋，在12 L/12 D條件下同心輪紋均勻；在全黑暗條件下，菌落絨毛狀菌絲較多，菌落較厚。

表1 不同培養(yǎng)基上玫煙色棒束孢IF-1106菌株菌落直徑及產(chǎn)孢量

注：經(jīng)Duncan多重比較，表中同列英文字母相同者表示在0.05水平上差異不顯著，表2～表5同。

Note：Means in the same column followed by the same letters are not significantly different, P>0.05.The same with Table 2 to Table 5.

表2不同光周期下玫煙色棒束孢菌落直徑及產(chǎn)孢量

Table2 The effect of photoperiods on mycelia diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

光周期Photoperiods菌落直徑Diameter ofmycelial/mm生長(zhǎng)回歸方程Regression equation(Y=b+aX)相關(guān)系數(shù)(R2)Correlation coefficient產(chǎn)孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-124L48.76±0.19aY=-1.405+4.627X0.9961.063±0.142c16L/8D38.76±0.34bY=4.953+3.121X0.9691.335±0.122bc12L/12D39.08±1.15bY=3.130+3.346X0.971.803±0.907ab8L/16D35.68±0.40cY=7.018+2.678X0.971.867±0.251a24D30.58±0.33dY=5.947+2.343X0.9591.992±0.165a

2.3 不同溫度對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

玫煙色棒束孢在15～30℃的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在不同溫度下，菌落直徑(F=113.0; df=3,16; P<0.001)及產(chǎn)孢量(F=69.94; df=3,16; P<0.001)有一定差異(表3)。在30℃時(shí)菌落直徑最大，培養(yǎng)11 d后菌落直徑達(dá)33.0 mm，在25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢最大，分別為2.486 mm·d-1和1.910×107孢子·mL-1。

2.4 不同通氣條件對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

玫煙色棒束孢菌株在平板培養(yǎng)過(guò)程中，封口和未封口的培養(yǎng)皿的菌落直徑(F=1.402; df=2,12; P=0.284)差異不顯著，產(chǎn)孢量(F=8.030; df=2,12; P=0.006)有一定差異(表4)。在不封口情況下，菌落生長(zhǎng)較快，菌落直徑最大，為35.8 mm，且菌落生長(zhǎng)速率最快，為2.841 mm·d-1，產(chǎn)孢量也較大，為4.56×106孢子·mL-1。

表3不同溫度下玫煙色棒束孢IF-1106菌株菌落直徑及產(chǎn)孢量

Table3 The effect of temperatures on mycelial diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

溫度Temperature/℃菌落直徑Diameter of mycelial/mm生長(zhǎng)回歸方程Regression equation(Y=b+aX)相關(guān)系數(shù)(R2)Correlation coefficient產(chǎn)孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-110不生長(zhǎng)1522.18±0.33cY=1.860+1.864X0.9890.314±0.014c2028.94±0.13bY=4.315+2.339X0.9571.245±0.049b2529.14±0.59bY=3.142+2.486X0.9391.910±0.168a3033.04±0.92aY=6.123+2.471X0.9790.471±0.019c35不生長(zhǎng)40不生長(zhǎng)

表4不同通氣條件下玫煙色棒束孢IF-1106菌株菌落直徑及產(chǎn)孢量

Table4 The effect of ventilation conditions on mycelial diameter and sporulation ofIsariafumosoroseaIF-1106 strain

通氣條件Ventilation菌落直徑Diameter of mycelial/mm生長(zhǎng)回歸方程Regression equation(Y=b+aX)相關(guān)系數(shù)(R2)Correlation coefficient產(chǎn)孢量/×107孢子·mL-1Sporulation yields/×107 spore·mL-1保鮮膜封口33.82±0.53aY=5.768+2.600X0.9790.334±0.017bParafilm膜封口34.82±1.33aY=6.327+2.727X0.9480.368±0.008b不封口35.84±0.37aY=5.750+2.814X0.9680.456±0.033a

2.5 不同初始pH條件對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

玫煙色棒束孢在初始pH值為5～10的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但不同初始pH條件下的菌落直徑(F=63.15; df=5,24; P<0.001)及產(chǎn)孢量(F=62.83; df=5,24; P<0.001)有一定差異(表5)。初始pH值為7時(shí)，菌落直徑及產(chǎn)孢量最大，分別為36.9 mm和5.69×106孢子·mL-1，在初始pH值為7條件下菌落生長(zhǎng)速率最快，為3.347 mm·d-1。隨著初始pH值的升高或降低，菌落直徑及產(chǎn)孢量逐漸減小。

表5 不同初始pH條件玫煙色棒束孢IF-1106菌株菌落直徑及產(chǎn)孢量

3 結(jié)論與討論

玫煙色棒束孢最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。玫煙色棒束孢在6種試驗(yàn)培養(yǎng)基上均可產(chǎn)孢，說(shuō)明該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求較低，對(duì)碳源要求不高，可利用葡萄糖、蔗糖及麥芽糖，氮源既可利用有機(jī)氮也可利用無(wú)機(jī)氮，可見(jiàn)玫煙色棒束孢易于大規(guī)模培養(yǎng)。

溫度是影響菌株生長(zhǎng)的重要因子之一[15]。不同地理來(lái)源的菌株，其生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度范圍不同，根據(jù)代表溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)37個(gè)玫煙色棒束孢菌株生物學(xué)特性研究，歐洲菌株的生長(zhǎng)最適溫度為20～25℃，美國(guó)和西亞菌株的生長(zhǎng)最適溫度為25～28℃，來(lái)自印度季風(fēng)氣候區(qū)的菌株最耐高溫，在32～35℃高溫下仍然生長(zhǎng)[15]。試驗(yàn)菌株在15～30℃的范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，30℃條件下菌落生長(zhǎng)最快，但25℃條件下產(chǎn)孢較多，因此生長(zhǎng)所需溫度比產(chǎn)孢高。

光周期對(duì)玫煙色棒束孢菌落的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均有一定影響。從試驗(yàn)中可以得出，光照可以促進(jìn)菌落生長(zhǎng)但會(huì)抑制產(chǎn)孢。雷妍圓[16]研究表明隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)速率有所增加，但產(chǎn)孢量有所下降。該結(jié)果與其一致。光照可以促進(jìn)菌落生長(zhǎng)，此時(shí)該菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，但是卻抑制了菌的生殖生長(zhǎng)，造成產(chǎn)孢量的下降。因此可以考慮在培養(yǎng)前期給予一定的光照，先讓其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，至后期再轉(zhuǎn)為全黑暗培養(yǎng)以利于其產(chǎn)孢。

不封口的情況下玫煙色棒束孢菌絲生長(zhǎng)比封口情況相對(duì)較好，而且不封口的情況下產(chǎn)孢量較大。用2種封口材料封口后，對(duì)菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響無(wú)顯著差異，因此若在一些特定條件下需要封口培養(yǎng)，可用家用保鮮膜封口以節(jié)約成本。

酸堿度對(duì)玫煙色棒束孢菌落的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢也有影響。pH值為7時(shí)最適合玫煙色棒束孢生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。

綜上所述，玫煙色棒束孢最適培養(yǎng)條件為：初始pH值為7的PDA培養(yǎng)基，25℃條件下全黑暗、不封口培養(yǎng)。

參 考 文 獻(xiàn)

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