高振峰，張寶俊，劉慧芹，劉慧平 ，韓巨才

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801; 2.天津農(nóng)學(xué)院 園藝系， 天津 300384)

植物內(nèi)生真菌是最早被發(fā)現(xiàn)、最早被開發(fā)應(yīng)用的一類植物內(nèi)生菌。與其他內(nèi)生菌相比，植物內(nèi)生真菌具有數(shù)量多、分布廣、所產(chǎn)生活性物質(zhì)種類多等特點(diǎn)。植物內(nèi)生真菌代謝的活性物質(zhì)主要有生物堿類、肽類、萜類、甾體類、酚類、醌類等化合物[1～3]，其中還有許多亟待開發(fā)的新物質(zhì)，特別是植物內(nèi)生真菌在篩選新型抗菌藥物中有著巨大潛力。Strobel等[4]從短葉紅豆杉的韌皮部分離到產(chǎn)新型抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，張玲琪[5]、郭波[6]等均從長(zhǎng)春花莖皮中分離到了產(chǎn)抗癌物質(zhì)長(zhǎng)春新堿的內(nèi)生真菌。在植物病害生防方面，植物內(nèi)生真菌也具很好的開發(fā)前景。近年來，我國(guó)的付建紅[7]、楊潤(rùn)亞[8]、宋萍[9]、田小曼[10]、楊明琰[11]等眾多學(xué)者從經(jīng)濟(jì)林木、藥用植物、雜草等植物中分離到了大量的內(nèi)生真菌，并在菌種多樣性、抗病菌株篩選、活性成分分析、與寄主植物關(guān)系等方面進(jìn)行了深入的研究。酸棗(Ziziphusjujubevar.spinosa)作為一種野生藥用植物，有著極為豐富的藥用成分，但是有關(guān)酸棗內(nèi)生真菌的研究還少見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)酸棗內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離、純化，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)了研究，旨在豐富具有抑菌活性的內(nèi)生真菌資源，分離具有生物活性的抗菌物質(zhì)，為微生物源農(nóng)藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

酸棗的根、莖、葉于2012年8月采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

1.1.2 供試病原菌

梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 酸棗內(nèi)生真菌的分離與純化

將采集的植物材料用自來水沖洗30 min后進(jìn)行表面消毒，程序?yàn)椋合扔?5%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，3%的次氯酸鈉浸泡3 min，無菌水沖洗后將消毒的材料用無菌刀片截成1 cm左右的小段，置于PDA培養(yǎng)基中[12]，28℃恒溫培養(yǎng)，4 d后采用尖端菌絲純化法進(jìn)行純化，根據(jù)形態(tài)、顏色、菌落的不同分類保存。

1.3 酸棗內(nèi)生拮抗真菌的篩選

拮抗真菌的篩選采用平板對(duì)峙法[13]，將所分離的內(nèi)生真菌放置于PDA平板上，在其約3 cm處分別接直徑為5 cm的病原真菌菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測(cè)定內(nèi)生真菌的抑菌活性。以只接病原真菌為對(duì)照，3次重復(fù)。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5 mm)×100%

1.4 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

將篩選的各拮抗菌株接種于PDA的液體培養(yǎng)中，28℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)96 h。用無菌紗布過濾獲得菌絲體，晾干備用。發(fā)酵液在4℃、10 000 r·min-1離心10 min取上清發(fā)酵液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾滅菌。采用生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定各菌株的發(fā)酵液活性，將各處理1 mL發(fā)酵液與9 mL PDA培養(yǎng)基混合制備平板，分別接入直徑5 mm的5種病菌菌塊，28℃培養(yǎng)。5 d后測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑菌率，對(duì)照以無菌水替代發(fā)酵液，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗內(nèi)生真菌的分離

本試驗(yàn)從酸棗不同部位分離到的內(nèi)生真菌經(jīng)純化培養(yǎng)后，共獲得40株內(nèi)生真菌菌株，其中根部為20株，莖部15株，葉部5株。從分離結(jié)果可以看出，酸棗內(nèi)生真菌的分布情況為根部最多，莖部次之，葉部最少。

2.2 酸棗內(nèi)生真菌抑菌活性初篩

經(jīng)測(cè)定，所分離的酸棗內(nèi)生真菌中有25株具有抑菌活性，其中對(duì)B.cinerea的抑制率在40%～72%；對(duì)A.alternata的抑制率在19.5%～59.8%。其中SZJ-2、SZJ-5和SZJ-8的抑菌效果顯著，對(duì)A.alternata和B.cinerea均有較好的抑制作用，對(duì)A.alternata的抑制率分別為59.2%、59.8%、53.5%；對(duì)B.cinerea的抑制率分別為70%、72%、70%。

2.3 拮抗真菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

3株內(nèi)生真菌原始發(fā)酵液的抑菌活性如表1所示。SZJ-2對(duì)A.solani、B.cinerea、A.alternata、F.oxysporiumf.sp.vasinfectum和R.solani5種病原真菌的抑菌活性分別為70.7%、55.1%、66.7%、30.6%和36.6%；SZJ-5菌株為65.5%、29.2%、63.0%、15.3%和25.6%；SZJ-8菌株為62.1%、53.9%、57.4%、6.3%和31.7%。3株內(nèi)生真菌對(duì)5種病原真菌的抑菌活性存在顯著差異，其中對(duì)A.Solani和A.Alternata有著較強(qiáng)的抑菌活性，抑制率均在50%以上，對(duì)A.Solani的抑菌活性最強(qiáng)，其次是A.Alternata；此外，3株內(nèi)生真菌中除了SZJ-5對(duì)B.cinerea的抑菌活性為29.2%外，其他2株內(nèi)生真菌對(duì)B.cinerea的抑菌活性均在50%以上。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用組織分離方法對(duì)酸棗內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，以最后一次無菌水沖洗液為對(duì)照檢測(cè)分離結(jié)果的可靠性。通過對(duì)分離到的40株內(nèi)生真菌進(jìn)行初篩發(fā)現(xiàn)25株具有抑菌活性，占分離總數(shù)的62.5%，其中SZJ-2、SZJ-5和SZJ-8有著較強(qiáng)的抑菌作用，說明在酸棗體內(nèi)存在著具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，進(jìn)一步證實(shí)了藥用植物中存在著豐富的內(nèi)生拮抗真菌。隨后對(duì)3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)酵液經(jīng)過濾處理后對(duì)番茄早疫病菌、梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌有著較強(qiáng)的抑制作用，SZJ-2和SZJ-8的抑制率均在50%以上，SZJ-5除了對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率低于50%外，對(duì)其它2種病菌的抑菌活性均超過50%。SZJ-5發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性與菌株自身的抑菌活性表現(xiàn)出明顯反差的原因可能是菌株SZJ-5對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性物質(zhì)存在于菌絲體內(nèi)而非胞外代謝物中，具體原因需下一步對(duì)菌絲中的活性物質(zhì)進(jìn)行提取驗(yàn)證。通過試驗(yàn)證實(shí)3株內(nèi)生真菌在防治番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和梨黑斑病菌上具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步對(duì)這3株內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)研究，如進(jìn)行菌種的鑒定、代謝物中抑菌活性物質(zhì)的分離純化、植物體內(nèi)定殖力測(cè)定等，為生物農(nóng)藥的開發(fā)及應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

表1 3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)5種病原真菌的抑菌率(%)

注：同行的字母表示新復(fù)極差檢驗(yàn)在P=0.05水平差異不顯著。

Note： The data in the same row following by the same letters are not significantly different by Duncan's test (P=0.05).

參 考 文 獻(xiàn)

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