定武燕，尚世輝,楊倩,王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬齒莧(PortuLacaoteracea)為馬齒莧科(PortuLaeaceae)馬齒莧屬(PortuLacaL.)一年生肉質(zhì)草本植物，也稱五行草、酸味草、長命草等，生于菜園、農(nóng)田、路旁、荒地等，為常見雜草，是古今聞名的佳蔬良藥[1]。馬齒莧原產(chǎn)于印度，后傳播到世界各地，廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū)。我國大部分地區(qū)的田邊、地角和荒地均可見到野生馬齒莧[2]。

目前發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于多種陸生及水生植物中。從各種農(nóng)作物及果樹等經(jīng)濟(jì)作物中分離到的內(nèi)生細(xì)菌已超過129種(分別屬于54個(gè)屬)。這些內(nèi)生細(xì)菌大多為土壤微生物種類。因此，人們開始認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌存在于大多數(shù)高等植物體內(nèi)[3]。

分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌最常用、最有效的方法就是16S rDNA鑒定法。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。16S rDNA由于大小適中，約1.5 kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家所接受[4]。16S rDNA鑒定法包括16S rDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟，是常用的快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法[3]。

隨著植物內(nèi)生細(xì)菌越來越多地被分離，它們的作用也不斷被揭示。其中作為外源基因的載體，產(chǎn)生抗菌素、某些酶類等次生代謝產(chǎn)物以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性，促進(jìn)植物生長，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位等是其主要功能。因此，植物內(nèi)生細(xì)菌的研究雖然起步較晚，但是由于其具有較大的潛在價(jià)值和較廣的拓展空間，現(xiàn)在已經(jīng)成為重點(diǎn)研究對(duì)象之一。

我國的植物內(nèi)生細(xì)菌資源極其豐富，只是對(duì)野生植物的內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，而對(duì)馬齒莧內(nèi)生細(xì)菌的研究目前尚未見報(bào)道。本文采用微生物形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)馬齒莧內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康野生馬齒莧全株，于2013年4月采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。 采后置于保鮮袋中，于4℃條件下保存，采樣后8 h內(nèi)處理樣品。

1.2 內(nèi)生菌的分離及純化

取健康馬齒莧全株，洗凈晾干后，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理，首先用5% NaClO浸泡5 min，再用無菌水沖洗3～5次，收集最后一次用的無菌水，用無菌濾紙吸干植株上的水分，使用75%乙醇滅過菌的研砵和研磨棒，在無菌狀態(tài)下將馬齒莧研磨成糊狀，再用無菌水將勻漿稀釋到1/10倍、1/100倍、1/1000倍，之后分別取1 mL涂布于新鮮的NA培養(yǎng)基[5]上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。同時(shí)，將最后一次漂洗用的無菌水和未研磨但進(jìn)行了以上表面消毒處理的植株分別接入培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以證明試驗(yàn)材料表面消毒充分徹底，得到的菌株是內(nèi)生菌而非表生菌。

待長出菌落后根據(jù)菌落形態(tài)分類法，將得到的菌落初步分類得到B1，B2，B3，B4，B5，B6 6種，在超凈臺(tái)下轉(zhuǎn)接于NA培養(yǎng)基平板(標(biāo)號(hào)B1，B2，B3，B4，B5，B6)上，轉(zhuǎn)接時(shí)在平板上畫“Z”形以便得到各菌株的單菌落。反復(fù)純化后，當(dāng)單菌落長出，再轉(zhuǎn)接于試管斜面上，進(jìn)行菌種的鑒定及保存。

1.3 內(nèi)生菌的菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)方法

首先根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌主要群落形態(tài)特點(diǎn)(菌落大小、顏色、形態(tài))進(jìn)行初步分類[6]并記錄。然后挑取少量菌體，制成臨時(shí)裝片，用革蘭氏染色液對(duì)細(xì)菌進(jìn)行單染色。

1.3.2 分子生物學(xué)方法

1.3.2.1 引物

16S rDNA基因序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物：正向引物5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，反向引物5-GGTACCTTGTTACGACTT-3[7]。

1.3.2.2 菌落PCR

PCR混合液的制備:

Taq buffer(10×) 2μL

dNTP(2.5 mM) 1.6 μL

Primer Forward(引物濃度2 μM) 2 μL

Primer Reverse(引物濃度2 μM) 2 μL

ddH2O 10.3 μL

rTaq(2 U·μL-1) 0.1 μL

常溫下，用槍頭挑選單菌落到裝有15 μL dd水的PCR管中，然后懸浮菌液。在做PCR時(shí)，吸取2 μL做模板，挑好單克隆菌落后將之前配制好的PCR混合液加入體系是20 μL。將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，16℃保溫。其中退火溫度設(shè)有5個(gè)梯度51℃、52℃、53℃、54℃、55℃。尋找每種菌的最適退火溫度，使擴(kuò)增順利完成。

1.3.2.3 測(cè)序

PCR 產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳20 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。切膠后利用DNA回收試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司)回收。然后將回收產(chǎn)物交由北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為1492R和27F。

1.3.2.4 搖菌

電泳檢測(cè)后，取有陽性克隆相對(duì)應(yīng)的菌液10 μL于試管中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.2.5 序列對(duì)比

用BLAST進(jìn)行序列對(duì)比，找到相似度在95%以上的菌屬，以確定該菌株的種屬分類定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離及純化

將研磨好的勻漿接入分離NA培養(yǎng)基，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h長出菌落。對(duì)照組的平板上沒有出現(xiàn)菌落，說明試驗(yàn)中的馬齒莧表面消毒充分徹底，得到的菌株為植株的內(nèi)生菌。自菌落出現(xiàn)后再培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌種的分離純化，當(dāng)單菌落長出后，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基上保存。從馬齒莧中共分離得到6種細(xì)菌，菌落形態(tài)如圖1所示，其形態(tài)描述見表1。

圖1 馬齒莧內(nèi)生菌菌落形態(tài)圖Fig.1 P.oteracea endophytic bacteria colony morphology

2.2 內(nèi)生菌的菌種鑒定

2.2.1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增的16S rDNA片段

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 菌落PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2 ColonyPCR amplified fragments in polyacrylamide gel electrophoresis

菌落編號(hào)NO.菌落顏色Colors菌落形狀Shape菌落濕度Moisture菌落邊緣Edge透明度Transparency革蘭氏GramB1乳白圓形較濕潤整齊模糊陰性B2白色圓形干澀褶皺半透明陽性B3淡黃圓而小濕潤整齊半透明陰性B4淺白小而平干澀較整齊半透明可變B5淡黃圓而小濕潤略褶皺半透明陽性B6乳白圓形較濕潤整齊模糊陰性

從圖2可見，電泳得到了清晰、單一的條帶，條帶亮度不同可能是由于挑取菌落大小不一，使得模板量不同導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物有多有少。但與Marker對(duì)比可知片段長度都接近1.5 kb,因此初步判斷得到的就是目的片段，進(jìn)一步測(cè)序可以最終確定。

2.2.2 16S rDNA測(cè)序結(jié)果

切膠后利用DNA回收試劑盒回收并測(cè)序。結(jié)果見表2。

表2 馬齒莧內(nèi)生菌分子鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性眾所周知，但不同植物之間也有一定的相似性。雖然之前沒有關(guān)于馬齒莧內(nèi)生細(xì)菌的分離和鑒定的相關(guān)報(bào)道，但根據(jù)前人對(duì)其他陸生植物所作的研究可知，比較常見的屬主要為:假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(BaciLLus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)等[8～21]。本試驗(yàn)中從馬齒莧中得到的菌種與他們的結(jié)果相符，而且本試驗(yàn)分離出的幾種內(nèi)生細(xì)菌，只是體外易培養(yǎng)的，菌落易被分辨的幾種，不能代表馬齒莧的全部?jī)?nèi)生細(xì)菌。

本試驗(yàn)成功的關(guān)鍵有兩點(diǎn)：其一，排除表生菌的干擾。 用1%、3%、5% NaClO分別對(duì)材料處理1，3，5 min進(jìn)行9 組試驗(yàn)，對(duì)照確定了最佳滅菌方法為5%次氯酸鈉處理 5 min。其二,結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法與現(xiàn)代分子學(xué)檢測(cè)手段，結(jié)果更準(zhǔn)確。有兩方面有待完善:一，用培養(yǎng)基來培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，不能保證所有生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌全部被分離出來，可能有的內(nèi)生細(xì)菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，也有可能是植物正處在非內(nèi)生性病原菌感染初期。 因此，建立與宿主植物內(nèi)環(huán)境類似的生態(tài)模型，才能真實(shí)反映植物內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特征; 二，不同植物的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量差異較大而且具有可變性。因此,對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究還需綜合多方面因素。

在以后的試驗(yàn)中，可以針對(duì)更多的野生植物進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定，加強(qiáng)各類植物內(nèi)生細(xì)菌資源的研究。 這些研究從應(yīng)用上看，將有助于發(fā)現(xiàn)新功能性菌株，促進(jìn)植物的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的拓展;從理論上看，將有助于對(duì)植物內(nèi)生菌的全面了解,促進(jìn)菌植協(xié)同進(jìn)化理論的發(fā)展，為植物功能性內(nèi)生菌的篩選提供理論指導(dǎo)。本論文為這些后續(xù)工作提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)與參考。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]李英霞,孔維蘭,陳萍,等.馬齒莧藥理研究新進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)藥,1999,10(9):7-12.

[2]朱麗，徐為公，趙廣榮，等．馬齒莧的研究現(xiàn)狀與綜合開發(fā)利用[J]． 河北林果研究，2006，21( 2)：198-201.

[3]Patel JB，Leonard DG，Pan X，et al.Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacteriaL identification system[J].Journal of Clinical Microbiology，2000,38(1)：246-251.

[4]Woese CR.BacteriaL evoLution[J].Microbiol Rev，1987，51(2)：221-271.

[5]程永寶.微生物學(xué)試驗(yàn)與指導(dǎo)[M].北京:中國醫(yī)學(xué)科技出版社,1994:195-197.

[6]李琳,李槿年，余為一.細(xì)菌分類鑒定方法的研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(3):45-60.

[7]Persing DH,Tenover FC,Tang YW,et al.Molecular microbiology：dignostic principles and practice[M].Washigton DC ：American Society for Microbiology，2003：454-483.

[8]龍良鯤,肖崇剛,竇彥霞.防治番茄青枯病內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選[J].中國蔬菜,2003,2:19-21.

[9]袁紅旭,周立賴,周錦蘭,等.富貴竹內(nèi)生細(xì)菌群落的生物效應(yīng)研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,13(1):95-97.

[10]蘆云,羅明.哈密瓜內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào),2004,22:104-109.

[11]邱思鑫,何紅,阮宏椿,等.具有抑菌促生作用的植物內(nèi)生細(xì)菌的篩選[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004,10(5):655-659.

[12]何紅,蔡學(xué)清,洪永聰,等.辣椒內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].中國生物防治,2002,18(4):171-175.

[13]崔林,孫振,孫福在,等.馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分離及環(huán)腐病拮抗菌的篩選鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(4):353-358.

[14]羅明,蘆云,張祥林.棉花內(nèi)生細(xì)菌的分離及生防益菌的篩選[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,41(5):277-282.

[15]蘭海燕,王長海,宋榮.棉花內(nèi)生細(xì)菌及其研究進(jìn)展[J].棉花學(xué)報(bào),2003,12(2):105-108.

[16]高增貴,莊敬華,陳捷,等.玉米根系內(nèi)生細(xì)菌種群及動(dòng)態(tài)分析[J ].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2004,15(8):1344-1348.

[17]李庚花，楊民和，蔣軍喜,等.茄科植物內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌的篩選[J].江西植保,2005,28(1):10-11.

[18]馬冠華,肖崇剛.煙草內(nèi)生細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)研究[M].微生物學(xué)雜志,2004,24(1):7-12.

[19]楊海蓮,孫曉璐,宋未,等.水稻內(nèi)生聯(lián)合固氮細(xì)菌的篩選、鑒定及其分布特性[J].植物學(xué)報(bào),1999,41(9):927-931.

[20]劉云霞,張青文,周明牂.水稻體內(nèi)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),1999,10(6):735-738.

[21]王萬能,肖崇剛.煙草內(nèi)生細(xì)菌118防治黑脛病的機(jī)理研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(1):28-31.