姚眾，韓巨才，劉慧平，劉東，張寶俊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

植物內(nèi)生細(xì)菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物根、莖、葉等組織的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的一類細(xì)菌，與宿主植物建立和諧聯(lián)合共生的關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1,2]。植物內(nèi)生細(xì)菌中廣泛分布著抗菌活性菌株，亦可產(chǎn)生具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。迄今為止，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌抑制病原菌的研究已積累了大量資料，在防治真菌性病害、細(xì)菌性病害和線蟲病害等方面發(fā)揮了巨大作用。Rauye Shwaran等[3]從鷹嘴豆、向日葵、辣椒植物莖內(nèi)分離篩選到10株對(duì)鐮刀菌、菌核菌、絲核菌有明顯抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌；崔林等[4]從馬鈴薯組織內(nèi)分離到55株對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌；李進(jìn)榮等[5]從大豆根瘤內(nèi)分離出4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)大豆胞囊線蟲孵化有強(qiáng)烈的抑制作用。由于生物農(nóng)藥良好的應(yīng)用前景及化學(xué)農(nóng)藥的過度使用存在環(huán)境污染、3R(Residue、Resistance、Resurgence)問題等，近年來從植物中分離篩選具有生防作用的內(nèi)生細(xì)菌以已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

皂莢(GleditsiasinensisLam)是中國特有的蘇木科皂莢屬樹種之一，是食品、化妝品、洗滌用品等的天然原料，亦是一種中藥材，有祛痰止咳、開竅通閉、抗菌殺蟲等藥理作用[6]。目前尚未見對(duì)皂莢內(nèi)生細(xì)菌有詳細(xì)的研究報(bào)道。本研究對(duì)皂莢內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離篩選，并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析研究，旨在篩選出能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，為皂莢的綜合開發(fā)利用及尋找新的抗菌藥物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物組織

供試的植物組織均采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)健康皂莢樹的枝、葉等不同部位。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基。

1.1.3 拮抗指示菌

梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.capsicum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化

將新鮮無病蟲害的植物組織用清水沖洗干凈后進(jìn)行表面消毒處理[7,8]：75%的酒精浸泡3～5 min，無菌水沖洗3次，再在3%的次氯酸鈉中浸泡3～5 min，用無菌水沖洗5次。取最后一次沖洗的無菌水200 μL涂布于平板培養(yǎng)基上做對(duì)照。將葉片用滅菌的解剖刀切成0.5 cm ×0.5 cm大小，莖部樣品裁剪為0.5 cm左右的小段，用滅菌刀片縱向剖開，緊貼于NA培養(yǎng)基上于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待材料周圍長出菌落后，采用劃線法分離、純化，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等分類保存。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對(duì)峙法[9]：在PDA平板中央接入直徑5 mm的病原菌菌塊，距離菌塊2 cm處的2個(gè)點(diǎn)對(duì)稱接種細(xì)菌菌體，以不接細(xì)菌作為對(duì)照，25℃恒溫避光培養(yǎng)5 d，觀察病原菌菌落生長狀況，測定菌落直徑，分析細(xì)菌菌體對(duì)病原菌的抑制率。

1.2.3 拮抗菌株代謝產(chǎn)物分析

將分離到的內(nèi)生細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)液中，28℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，得到拮抗菌株發(fā)酵液。8000 r·min-1離心10 min去除菌體，上清液分2種方式進(jìn)行處理[10]。方法1：0.45 μm微孔濾膜過濾滅菌；方法2：121℃高壓濕熱滅菌30 min。采用生長速率法測定各菌株的發(fā)酵液活性：將各處理發(fā)酵液按1∶9的比例與PDA培養(yǎng)基混合，制備平板，并在平板中央接入直徑為5 mm的新鮮病菌菌塊，5 d后測定菌落直徑，計(jì)算抑菌率。以LB培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

1.2.4 抗菌譜分析

用生長速率法對(duì)最終篩選的2個(gè)拮抗菌株ZJ4和ZJ7代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌廣譜性測定。發(fā)酵液經(jīng)濾膜過濾滅菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

從所有分離獲得的細(xì)菌中篩選、純化得到26個(gè)菌株。以梨黑斑病菌和灰霉病菌為指示菌，用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選出12株抑制率均高于60%的菌株為拮抗菌株，分別編號(hào)為ZJ1～ZJ12，其抑菌活性見表1。分離的12株內(nèi)生細(xì)菌其菌體對(duì)梨黑斑病菌抑菌率最高的為ZJ4，抑制率達(dá)74.3%，其次為ZJ9，抑制率為67.6%；其菌體對(duì)番茄灰霉病菌抑菌率最高的為ZJ7，抑制率達(dá)74.6%，其次為ZJ4，抑制率為71.4%。

表1 12個(gè)菌株對(duì)梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用

Table1 Antagonism of 12 strains toA.alternataandB.cinerea

菌株Strains 對(duì)梨黑斑病菌抑制率Inhibition rate againstA.alternata/%對(duì)番茄灰霉病菌抑制率Inhibition rate againstB.cinerea/%ZJ167.565.5ZJ262.466.7ZJ363.363.9ZJ474.371.4ZJ564.663.9ZJ664.665.5ZJ767.574.6ZJ862.460.3ZJ967.666.7ZJ1067.568.3ZJ1165.863.9ZJ1266.363.9

2.2 拮抗菌株代謝產(chǎn)物分析

代謝產(chǎn)物對(duì)梨黑斑病菌抑菌活性見表2， 12個(gè)菌株的次生代謝物質(zhì)對(duì)梨黑斑病菌的抑制作用差異較大，ZJ7菌株的無菌發(fā)酵液抑菌效果最佳，對(duì)梨黑斑病菌的抑制率達(dá)82.15%，其次是ZJ4，抑制率為80.26%，表明這2個(gè)菌株的次生代謝物中含有大量的抗菌物質(zhì)。發(fā)酵液經(jīng)高溫滅菌處理后ZJ4、ZJ7的抑菌活性明顯下降，推測該菌株可能代謝產(chǎn)生對(duì)熱敏感的蛋白類物質(zhì)；而ZJ1、ZJ2、ZJ5等菌株經(jīng)高溫處理后的抑菌活性無明顯喪失，表明其抗菌物質(zhì)對(duì)熱不敏感，推測其抗菌物質(zhì)可能為抗生素類或多肽類物質(zhì)。ZJ4、ZJ7菌株活性高，可作為潛在生防菌進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 12個(gè)菌株代謝產(chǎn)物對(duì)梨黑斑病菌的拮抗作用

Table2 Antagonism of the metabolites of 12 strains againstA.alternata

菌株Strains過濾處理抑菌率Inhibition rate of filteredby 0.45μm filter/%高溫處理抑菌率Inhibition rate oftreated by autoclaving/%ZJ144.2941.58ZJ250.0248.05ZJ362.3317.4ZJ480.264.08ZJ575.8568.05ZJ655.3640.25ZJ782.157.61ZJ859.2140.25ZJ945.5814.29ZJ1059.1840.14ZJ1172.5150.63ZJ1256.4612.93

2.3 ZJ4和ZJ7代謝產(chǎn)物抗菌譜分析

ZJ4和ZJ7菌株的抗菌譜測定結(jié)果見表3。2菌株對(duì)番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、棉花立枯病菌、辣椒枯萎病菌5種植物病原菌具有不同程度的拮抗作用，ZJ4菌株對(duì)梨黑斑病菌的抑制率最高，為83.99%，ZJ7菌株對(duì)番茄早疫病菌的抑制率最高，為82.58%，2菌株對(duì)西瓜枯萎病菌均沒有抑制作用。2菌株對(duì)不同病原菌的抑制作用表現(xiàn)出一定的選擇性，對(duì)鏈格孢屬的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌效果較好。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，皂莢內(nèi)生細(xì)菌中廣泛分布著抑菌活性菌株(占分離菌株總數(shù)的50%左右)，其代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制作用差異較大，表明其代謝可能產(chǎn)生蛋白類、抗生素類或多肽類等多種抗菌物質(zhì)。篩選出的潛在生防菌ZJ4、ZJ7經(jīng)高溫滅菌處理后抑菌活性明顯下降，推測其可能代謝產(chǎn)生對(duì)熱敏感的蛋白酶類，而且其對(duì)不同病原菌的抑制作用表現(xiàn)出一定的選擇性，因此下一步將對(duì)抗菌物質(zhì)特別是抗菌蛋白進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步研究抗菌機(jī)理，探索其在農(nóng)作物病蟲害防治中的應(yīng)用途徑。

表3 ZJ4和ZJ7發(fā)酵液對(duì)6種植物病原菌的抑制率

Table3 Inhibition rate of the endophytic bacteria ZJ4 and ZJ7 on six plant pathogens/%

植物病原菌Pathogens ZJ4菌株Strain ZJ4 ZJ7菌株Strain ZJ7番茄早疫病菌A. solani79.0582.58番茄灰霉病菌B. cinerea 76.6272.56梨黑斑病菌A. alternata 83.9980.63棉花立枯病菌R. solani 34.0443.19辣椒枯萎病菌F. oxysporum f.sp. capsicum 37.00 48.25西瓜枯萎病菌F. oxysporum f.sp. niveum- -

注：“-”代表無抑菌作用。

Note： "-"denote not inhibition.

內(nèi)生菌生活于植物的根、莖、葉等組織器官中，一旦從寄主植物中分離出來后，由于生存環(huán)境的變化，某些特性可能會(huì)改變，菌種也容易出現(xiàn)退化、變異等現(xiàn)象[11]。因此，對(duì)初步篩選出來的菌株還需進(jìn)一步測定其生物學(xué)及生理生化特性，以確定其最適的培養(yǎng)和保存條件。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]林玲,喬勇升,顧本康,等.植物內(nèi)生細(xì)菌及其生物防治植物病害的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,24(6):969-974.

[2]韓繼剛,宋未.植物內(nèi)生細(xì)菌研究進(jìn)展及其應(yīng)用潛力[J].自然科學(xué)進(jìn)展,2004,14(4):16-21.

[3]Range shwaran R,WasnikarA R,PrasadR D.Isolation of endophytic bacteria for biological control of wilt pathogen[J].Journal of Biological Control,2002,16(2):125-133.

[4]崔林,孫振,袁軍,等.馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的分離及環(huán)腐病拮抗菌的篩選鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(4):353-358.

[5]李進(jìn)榮,段玉璽,陳立杰,等.大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌對(duì)大豆胞囊線蟲影響研究[J].大豆科學(xué),2005,24(2):154-156.

[6]梁靜誼.皂莢莢果化學(xué)組成及皂甙提取工藝的研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2004.

[7]張玉潔,李洪超.三七內(nèi)生菌分離及抗根腐病病原真菌篩選[J].北方園藝,2011(23):130-132.

[8]冀玉良,李丹青,李堆淑,等.連翹內(nèi)生菌的分離及對(duì)植物病原菌的抑菌活性測定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(6):2258-2262.

[9]何建清,張格杰,陳芝蘭,等.大花黃牡丹內(nèi)生菌的分離鑒定及其抗菌活性菌株的篩選[J].西北植物學(xué)報(bào),2011,31(12):2539-2544.

[10]王慧利.抗真菌活性水稻內(nèi)生菌的篩選及美達(dá)霉素生物合成中糖基化機(jī)制研究[D].武漢:華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2010.

[11]蔡永歡.喜樹內(nèi)生真菌的分離及其對(duì)植物病原菌的抑菌活性研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.