殷 曉，張春梅，李新崗，黃 建，王長柱，練春蘭

(1 西北農(nóng)林科技大學 a 林學院 陜西省林業(yè)綜合重點實驗室，b 園藝學院，陜西 楊凌 712100；2 東京大學 亞洲自然環(huán)境科學中心，日本 東京188-0002)

棗(ZiziphusjujubaMill.)是原產(chǎn)于我國的特有果樹，栽培歷史悠久，約有900個品種[1-2]。長期的栽培與馴化，使其變異類型極其豐富，已形成區(qū)域性品種和品種群[2-3]。晉陜黃河峽谷一帶是我國栽培棗的原產(chǎn)地和栽培中心[2-4]，也是我國優(yōu)良制干棗的主要栽培區(qū)[2,5]，一直保存著栽培棗的很多原生類型，以及酸棗到棗的中間過渡類型[2,4]。在我國棗的起源地和栽培中心，研究棗的遺傳結(jié)構(gòu)對于探明我國棗品種群的形成和發(fā)展具有重要意義。

關(guān)于棗分子水平的研究，過去主要采用RAPD[6-17]、AFLP[14-15,18-27]、SRAP[6,19,28]、ISSR[29-31]等技術(shù)探討了棗和酸棗的分類地位[6-7,10,12,16,28]、品種鑒定[13,15,17-20]、種質(zhì)的親緣關(guān)系[7-9,16,18,23-26,28,30]、親本鑒定[21-22]、遺傳圖譜[4,28]和遺傳多樣性[11,19,29,31]等。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，由于SSR標記具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳、特異性強等優(yōu)點[32]，在很大程度上替代了傳統(tǒng)的酶標記以及RAPD、AFLP等方法，已廣泛應(yīng)用于遺傳結(jié)構(gòu)和種質(zhì)鑒定研究中[33-35]。近年來，有學者利用SSR標記構(gòu)建了棗指紋圖譜[36]并進行了親本鑒定[37]，但利用SSR標記對棗品種群遺傳結(jié)構(gòu)進行研究尚未見報道。品種群(Cultivar group)是親緣關(guān)系相近的一類品種的集合[1]。一般認為，棗由酸棗演化而來[2,4]，在同一演化路線上的品種遺傳背景比較一致，分析品種間的遺傳關(guān)系，找出基本品種，以此劃分品種群，對于指導棗資源利用和育種實踐具有重要意義[13,20]。

為進一步闡明棗的遺傳結(jié)構(gòu)與品種群分化，本研究針對我國栽培棗的原產(chǎn)地和栽培中心——陜北棗區(qū)，選取4個區(qū)域(縣)8個品種群54份棗種質(zhì)為研究對象，利用SSR分子標記研究了棗在起源地的遺傳結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系，以期揭示棗品種群的分化情況，為棗資源利用和分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在陜北黃河峽谷由南向北選取延川、清澗、米脂和佳縣4個地理區(qū)域(縣)，采集陜北原產(chǎn)的團棗、木棗、牙棗、脆棗、疙瘩棗、狗頭棗、腰腰棗和辣節(jié)節(jié)棗等8個棗品種群的54份樣品(表1)，樣樹樹齡40年以上，間隔距離500 m以上，并進行GPS定位。參照《中國果樹志·棗卷》[2]和《中國棗種質(zhì)資源》[1]，記錄其形態(tài)特征和生物學特性。2012-06(花期)采集棗葉片樣品，硅膠干燥后于室溫密封保存[38]，葉片用于DNA提取。

1.2 棗基因組DNA的提取

用改良CTAB法[39]提取棗基因組DNA。利用QIAGEN TissueLyser Ⅱ高通量組織研磨儀(德國)破碎葉片，60 ℃溫浴30 min，先用氯仿/異戊醇(體積比24∶1)抽提，再用等體積異丙醇抽提，用預冷的體積分數(shù)80%乙醇沉淀DNA，然后用滅菌超純水過夜溶解。樣品經(jīng)NanoVue Plus超微量分光光度計(美國)檢測后保存于-30 ℃冰箱待用。

表1 陜北原產(chǎn)8個棗品種群的樣品來源與用途

1.3 棗DNA的PCR擴增及毛細管電泳檢測

選取7個高多態(tài)性棗SSR引物(BFU0308、BFU0377、BFU0561、BFU0574、BFU1157[36]和自主開發(fā)的Zjuju001和Zjuju021(GenBank序列號分別為KC117400和KC117409))進行PCR。PCR反應(yīng)體系為10 μL，內(nèi)含20～30 ng基因組DNA，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(德國)5 μL，反向引物和帶熒光標記的正向引物分別為3.2和0.8 pmol。按照QIAGEN Multiplex PCR Kit試劑盒(德國)的說明，PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預變性15 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；60 ℃ 30 min。擴增產(chǎn)物由東京大學森林分子生態(tài)學研究室ABI 3130XL測序儀(美國)采用毛細管電泳檢測，用GeneMapper 4.0軟件記錄和分析原始數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlEx 6.5軟件分析供試棗的遺傳多樣性[40]，計算稀有等位基因數(shù)(Nr)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、固定系數(shù)(F)、近交系數(shù)(Fis，F(xiàn)it，F(xiàn)st)、基因流(Nm)和Nei’s遺傳距離(D)等參數(shù)。

根據(jù)地理區(qū)域(縣)與品種群間的Nei’s遺傳距離，分別用NTSYSpc-2.10軟件[41]中的類平均聚類法(UPGMA)繪制樹狀圖，分析地理區(qū)域(縣)與品種群間的分化程度。

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Flexibin軟件[42]轉(zhuǎn)化為0/1矩陣后，利用NTSYS軟件計算種間Nei’s遺傳距離，再用MEGA 5.1軟件[43]的鄰近距離法(NJ)構(gòu)建親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陜北棗種質(zhì)的遺傳多樣性

經(jīng)檢測，用7對引物從陜北54份棗種質(zhì)中共獲得42個等位基因，其中引物BFU0308擴增的多態(tài)性位點最多(10個)，BFU0561擴增的多態(tài)性位點最少(3個)，平均每個位點等位基因數(shù)為6。

由表2可知，按地理區(qū)域(縣)劃分，從延川、清澗、米脂和佳縣每個區(qū)域的棗種質(zhì)中分別可觀察到6，1，1和4個稀有等位基因。有效等位基因數(shù)(Ne)為2.464～3.479；Shannon’s信息指數(shù)(I)為1.036～1.336；期望雜合度(He)為0.589～0.694，平均觀測雜合度(0.909)大于平均期望雜合度(0.634)；固定指數(shù)(F)為-0.587～-0.253。

表2 基于地理區(qū)域的陜北棗種質(zhì)的遺傳多樣性

由表3可以看出，按品種群劃分，團棗、木棗、狗頭棗和辣節(jié)節(jié)棗每個品種群內(nèi)分別可觀察到3，2，1和4個稀有等位基因。各品種棗的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.849～3.496；Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.567～1.284；期望雜合度(He)為 0.380～0.706，平均觀測雜合度(0.922)大于平均期望雜合度(0.555)；固定指數(shù)(F)為-1.000～-0.352。其中，狗頭棗品種群的Ne、He和I指標均最小，說明其遺傳多樣性較低，可能與其栽培地域狹窄(僅在延川)、變異類型少有關(guān)。

表3 基于品種群的陜北棗種質(zhì)的遺傳多樣性

2.2 陜北棗種質(zhì)的遺傳分化

由分子方差檢驗(AMOVA)檢驗結(jié)果(表4)可知，地理區(qū)域(縣)內(nèi)變異(97%)和品種群內(nèi)變異(91%，88%)均遠大于群間分化(3%，9%，12%)；品種群內(nèi)變異(91%，88%)小于地理區(qū)域(縣)內(nèi)變異(97%)。地理區(qū)域(縣)與品種群的Fis和Fit值均為負值；品種群的Fis值(-0.514，-0.522)小于地理種群(-0.387)，F(xiàn)it值(-0.308，-0.268)大于地理區(qū)域(縣)(-0.328)。品種群Fst值(0.136，0.167)大于地理區(qū)域(縣)(0.042)。品種群間平均基因流(1.584，1.250)均小于地理區(qū)域間平均基因流(5.653)。

表4 陜北棗種質(zhì)群體分化的AMOVA檢驗結(jié)果

圖1為4個地理區(qū)域(縣)棗種質(zhì)的Nei’s遺傳距離UPGMA聚類圖。由圖1可知，在遺傳距離為0.13處4個地理區(qū)域(縣)種質(zhì)被劃分為2個地理群。無定河(黃河分支)上游的清澗和米脂棗種質(zhì)遺傳距離最近(0.05)，首先聚為一支，然后在遺傳距離約為0.09處與佳縣聚為第Ⅰ類；第Ⅱ類只有延川一個區(qū)域，與其他區(qū)域親緣關(guān)系較遠, 這與該組中含有狗頭棗品種群有關(guān)(圖2)。

8個棗品種群的UPGMA聚類結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，在遺傳距離為0.99處8個棗品種群被分成2個類群。第Ⅰ類群為團棗-木棗類群，包括團棗、木棗、疙瘩棗、腰腰棗、牙棗和脆棗5個品種群。第Ⅰ類群又可分為3個亞類，其中親緣關(guān)系最近的是木棗品種群與疙瘩棗品種群，其相聚后再與腰腰棗品種群聚在一起，然后又與牙棗聚成一支，形成木棗品種亞類(第1亞類)；第1亞類與第2亞類團棗品種群親緣關(guān)系較近；第3亞類為脆棗品種群，單獨為一支，與第1亞類和第2亞類親緣關(guān)系較遠。第Ⅱ類群為狗頭棗品種亞群，包括延川狗頭棗和辣節(jié)節(jié)棗品種群。

圖1 基于Nei’s遺傳距離的陜北棗種質(zhì)地理區(qū)域聚類圖

2.3 陜北棗種質(zhì)的聚類分析

由54份陜北棗種質(zhì)的NJ聚類樹(圖3)可以看出，供試材料被分為2大類群。第Ⅰ類群共45份種質(zhì)，又可分為2個亞群，一支包括延川-清澗-米脂團棗品種群(5個延川團棗、3個清澗團棗和2個米脂團棗)、佳縣團棗品種群(JXTZ03，JXTZ04和JXTZ05)、木棗品種群(9個佳縣木棗、5個延川木棗、3個清澗木棗和2個米脂木棗)、疙瘩棗品種群(YCGD14和JXGD18)、脆棗品種群(YCCZ12和JXCZ17)、牙棗品種群(MZYZ07，JXYZ15和JXYZ16)和腰腰棗品種群(JXYY19和JXYY20)；另一支包括過渡類型的泥河溝酸團棗(JXTZ01)和小會酸團棗(JXTZ02)以及米脂木棗2號(MZMZ04)和狗牙棗1號(MZYZ06)。第Ⅱ類群共9份種質(zhì)，包括全部的延川狗頭棗品種群(5個)、延川脆棗(YCCZ13)和吊牙棗(YCYZ11)、清澗團棗4號(QJTZ04)以及辣節(jié)節(jié)棗(YCLJ20)。其中，除了清澗團棗4號(QJTZ04)外，延川、清澗和米脂的團棗幾乎都聚在一起；佳縣棗種質(zhì)全部在第Ⅰ類群，且各品種群親緣關(guān)系很近；狗頭棗品種群與其他棗品種群親緣關(guān)系較遠。

圖3 基于Nei’s遺傳距離的陜北54份棗種質(zhì)親緣關(guān)系聚類圖品種編號同表1

3 討 論

3.1 棗的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種遺傳潛力和應(yīng)對環(huán)境變化能力的重要指標，遺傳多樣性喪失常常導致物種的適合度下降[44]。平均期望雜合度受取樣的影響較小，因此常用它來度量群體的遺傳多樣性，其高低可反映群體的遺傳一致性程度[45]。本研究中各地理區(qū)域樣本的期望雜合度在0.589～0.694，平均期望雜合度為0.634，表明陜北棗在長期馴化與特殊生態(tài)環(huán)境下發(fā)生了中度雜合；其平均Shannon’s信息指數(shù)為1.141，說明所分析的棗品種群具有高遺傳多樣性與高變異性；固定系數(shù)與近交系數(shù)均為負值，表明供試品種在陜北棗區(qū)很少發(fā)生近交[46]。閆超等[47]對280個棗品種的結(jié)實特性研究后發(fā)現(xiàn)，棗樹結(jié)實多種多樣，且供試品種異花授粉均可結(jié)實，結(jié)實率顯著高于自花授粉；其中，陜北品種(牙棗和狗頭棗)均為異花授粉，且自花不育。這更好地解釋了棗具有較高的雜合性。

本研究中，4個地理區(qū)域8個棗品種群均觀察到了不同數(shù)量的稀有等位基因，其中可能存在與優(yōu)良性狀相關(guān)的遺傳變異和獨特基因型。佳縣棗品種的Ne、He和I均最小，而延川最大，說明延川棗種質(zhì)遺傳多樣性最高，這與延川包含與其他品種群親緣關(guān)系較遠的狗頭棗有關(guān)。佳縣棗種質(zhì)遺傳多樣性最低，其原因一方面可能是佳縣多為木棗品種群，而木棗品種群內(nèi)多樣性相對于不同品種群間多樣性??；另一方面，佳縣是最具代表性的栽培棗原產(chǎn)地，這里保存著原始品種類型[2-4]，表型差異明顯，但現(xiàn)存的千年古棗樹(如JXMZ12，果實圓型，果皮黑紅，風味偏酸)與其分化的木棗(如JXMZ11，果實錐型，風味偏酸；JXMZ07，早熟；JXMZ08，抗裂；JXMZ09，晚熟)親緣關(guān)系很近，說明原生木棗品種群的遺傳變異不大。

3.2 地理區(qū)域與品種群的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳結(jié)構(gòu)主要通過物種種群內(nèi)和種群間的遺傳分化來體現(xiàn)。遺傳分化系數(shù)是反映各亞群間遺傳分化的重要指標[45]。本研究中，品種地理區(qū)域間Fst為 0.042，說明4個區(qū)域間基本不存在遺傳分化；而7個棗品種群和4個棗品種群間的Fst分別為0.136和0.167，說明品種群間有中度到高度分化。AMOVA結(jié)果也表明，地理區(qū)域內(nèi)與品種群內(nèi)變異均遠遠大于區(qū)域間和品種群間分化，但品種群內(nèi)部變異較地理區(qū)域內(nèi)變異小。這與棗品種廣泛的基因交流(如品種混植)有關(guān)，使其均質(zhì)化[48]；也可能是由于資源一致性生境造成的[2]。這種現(xiàn)象在遠交的木本植物中比較普遍，如油橄欖[33]、葡萄[34]，其遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。本研究聚類結(jié)果表明，棗品種的遺傳相似性與地理區(qū)域無明顯關(guān)系，這也是地理區(qū)域間基因流較高的一個證據(jù)。

本研究中，品種群間平均基因流(7品種群和4品種群Nm分別為1.584和1.250)較小，這很好地印證了品種群間的中高度分化，各品種群在果實形狀、大小、品質(zhì)、豐產(chǎn)性、耐貯性和抗裂性等重要農(nóng)藝性狀上存在很大差異，如脆棗和狗頭棗多為大果形，牙棗為小果形；脆棗和牙棗雖品質(zhì)明顯優(yōu)于團棗和木棗，但耐貯性明顯低于團棗和木棗；脆棗皮薄肉脆，抗裂性差、裂果嚴重，而牙棗抗裂性強；脆棗為鮮食品種，其他多為鮮食、制干兼用品種。品種群UPGMA聚類結(jié)果表明，狗頭棗品種群與其他品種群，特別是木棗品種群的親緣關(guān)系較遠。前人對狗頭棗和早熟木棗的染色體核型進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，狗頭棗核型為2n=2x=24=10m+10sm+4st，不對稱性系數(shù)高達 64.54%；早熟木棗核型為2n=2x=24=12m+12sm，說明佳縣的早熟木棗更原始[49-50]。

3.3 棗種質(zhì)的遺傳關(guān)系

棗種質(zhì)NJ聚類結(jié)果表明，疙瘩棗、牙棗、腰腰棗與木棗品種群的親緣關(guān)系很近，極有可能是從原始品種木棗中產(chǎn)生的不同性狀變異株系形成的，如第Ⅰ類群中木條棗(YCMZ08，延川眼岔寺)、木疙瘩棗(YCGD14，劉高山村，晚熟，果實方形，果皮黑紅)與抗裂木棗(QJMZ05，馬牙棗，抗裂)遺傳距離幾乎為0，而果形有差異，又與長腰腰棗(即驢奶頭棗(JXYY20)，果實大，長卵形，品質(zhì)中上等，質(zhì)地較致密，制干，抗裂果)聚在一起，品質(zhì)口感不同，但都不易裂果；螅鎮(zhèn)抗裂木棗(JXMZ14，果實小，兼用，抗裂果)與牛奶脆棗(YCCZ12，果實大，品質(zhì)上等，質(zhì)地致密細脆，鮮食，易裂果)果實品質(zhì)與抗裂性不同，但遺傳相似性極高。

棗因基因突變和自然雜交等產(chǎn)生了很多變異類型，然后通過自然選擇和人為選擇等因素逐漸形成區(qū)域性棗品種群，這為良種優(yōu)選奠定了基礎(chǔ)。如與其他團棗距離較遠的沙團棗(JXTZ04)，平均單果質(zhì)量13.0 g，品質(zhì)上等，耐貯藏，豐產(chǎn)性高，抗裂果，是鮮食品種中的優(yōu)良種質(zhì)；狗頭棗屬兼用中晚熟大果型品種，品質(zhì)上等，耐貯藏，豐產(chǎn)性高，不抗裂果，都聚在第Ⅱ類群，但延川莊頭的狗頭棗3號(YCGT17)與其他4個狗頭棗親緣關(guān)系較遠，其原因還有待進一步比較研究。另外，本試驗發(fā)現(xiàn)同物異名現(xiàn)象，如第Ⅰ類群中狗牙棗1號(MZYZ06，卯疙瘩村，果形小)與米脂木棗2號(MZMZ04，高家渠村，果形小)遺傳距離為0，且表型差異??；過渡類型泥河溝酸團棗(JXTZ01，泥河溝)與小會酸團棗(JXTZ02，小會坪)，均為喬木型酸棗到棗的過渡類型，果型、枝、葉與栽培棗相似，果實風味偏酸，核大；第Ⅱ類群中，吊牙棗(YCYZ11)與脆棗(YCCZ13)的果實均脆甜，性狀比較相近。

同一區(qū)域的棗種質(zhì)并沒有聚在一起，而是按照品種群聚類。棗品種間同時存在同源同型(表型相似，親緣關(guān)系近)、同源異型(表型不同，親緣關(guān)系近)與異源同型(表型相似，親緣關(guān)系遠)，說明棗品種的演化有多條路線，同一演化路線上的品種遺傳背景比較一致，不同演化路線上的品種也會出現(xiàn)相似的表型特征。花粉形態(tài)[51]、同工酶[52]和RAPD[8]研究也證明了這一點。由于本研究所用標記及部分群體內(nèi)供試樣品較少，為探究中國棗品種群的遺傳結(jié)構(gòu)，還有待于大范圍、跨區(qū)域采樣，并將SSR標記與更先進的葉綠體基因測序技術(shù)結(jié)合起來進行研究。

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