王 琛，劉雪蘭，陳芳芳，余為一

(安徽農業(yè)大學 安徽省人獸共患病重點實驗室，安徽 合肥230036)

肽疫苗具有特異性強、安全、有效等特點，目前已經應用于癌癥、糖尿病等疾病的治療[1-2]，構建具有增強抗原遞呈免疫載體的嵌合體肽疫苗無疑是一種提高治療效果的有效方法。恒定鏈(Invariant chain，Ii)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，呈非多態(tài)性[3-4]，作為MHCⅡ類分子伴侶蛋白，在遞呈外源性抗原的過程中發(fā)揮著重要作用。Ii的CLIP片段占據MHCⅡ類分子內的肽結合區(qū)凹槽，阻止內源性多肽的結合[5-6]；當外源性抗原肽進入時，凹槽中的CLIP片段被酶解，抗原肽進入凹槽并被遞呈到細胞表面，以便被CD4+Th細胞識別，從而激活免疫應答[7]。

用抗原肽取代Ii的CLIP片段的嵌合體，其抗原肽占據MHCⅡ類分子“凹槽”，優(yōu)先進入MHCⅡ類分子輸運呈遞途徑，不僅可增強抗感染免疫，還可以改變異常免疫應答的性質[8]。Adams等[9]報道，用Ii關鍵基團Ii-key結構(即四肽LRMK，與CLIP區(qū)N端相連)與抗原肽連接構建的嵌合體具有免疫增強作用。目前，Ii-key結構成為重要的免疫載體，并在多肽疫苗中得到了應用[10-13]。此外，用小鼠Ii跨膜區(qū)(Cyt)、胞漿區(qū)(Tm)的功能片段連接抗原肽免疫小鼠，能夠增強免疫效應[14]。但是尚不清楚Ii這些功能片段的作用是否具有跨物種的限制。為此，本研究構建了基于雞Ii功能片段和新城疫病毒(NDV)的F306肽段中第二個抗原表位(即F2片段[15])的多個嵌合體，用其免疫小鼠，通過細胞共定位和抗體水平研究雞Ii活性片段在小鼠體內的免疫效果，以期為構建跨物種免疫載體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

COS-7細胞、Rosetta(DE3)以及DH5α均由安徽省人獸共患病重點實驗室保存；限制性內切酶、DL 2000 Marker、T4 DNA連接酶以及Premix ExTaq購自寶生物工程有限公司；小量質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等均購自OMEGA生物工程公司。用激光共聚焦顯微鏡(FV1000)的60×油鏡分別觀察紅色熒光(488 nm)和綠色熒光(515 nm)。

1.2 試驗動物

8周齡昆明系雌性小白鼠，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 嵌合體的構建

根據雞Ii鏈以及新城疫病毒F蛋白結構，以安徽省人獸共患病重點實驗室保存的重組質粒pGEX-4T-1-F306、pEGFP-C1-Ii為模板，根據質粒的酶切位點和目的基因片段序列，自行設計7對引物(表1)，由寶生物工程有限公司合成。采用PCR法構建嵌合體Ii-F2、Cyt/Tm/Ii-key/F2/Ap、Tm/Ii-key/F2/Ap、Ii-key/F2/Ap和Ii-key/F2，其結構見圖1。PCR反應體系為TaqBuffer(Mg+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、引物F 1.0 μL、引物R 1.0 μL、pEGFP-C1-Ii 0.5 μL和RTaq0.5 μL，加ddH2O至終容積150.0 μL；反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃熱變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 8 min， 4 ℃終止反應。

表1 基因片段與嵌合體引物序列

圖1 嵌合體結構示意圖

將各嵌合體片段分別插入pET-32a、pGEX-4T-1載體，構建重組質粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2、pET-32a-F2和pGEX-4T-1-F2，將其轉化至E.coliRosetta(DE3)工程菌中，然后將轉化后的菌株送上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定；同時，提取重組質粒用BamHⅠ/SalⅠ進行雙酶切鑒定。PCR擴增產物和雙酶切產物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 嵌合體抗原的制備與小鼠免疫

將上述1.2節(jié)中獲得的重組菌加入適量的IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)，振蕩培養(yǎng)5 h。用超聲波破碎菌體(180 W超聲5 s，間隔10 s，36個循環(huán))，經Native-PAGE電泳后，按于在江等[16]的方法用0.25 mol/L KCl切膠法純化融合蛋白，對純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳鑒定。

將試驗小鼠隨機分為6個試驗組和1個對照組，每組3只，6個試驗組小鼠分別用純化的His-Ii-F2、His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、His-Tm/Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2和His-F2融合蛋白腹腔注射免疫約100 μL/只，免疫劑量為50 μg/只。對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。常規(guī)免疫5周后眼球采血，收集血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗體檢測

采用間接ELISA法檢測嵌合體抗體效價，以重組質粒pGEX-4T-1-F2表達的GST-F2融合蛋白作為抗原包被酶標板。以辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，最后以鄰苯二胺(OPD) 進行顯色反應，室溫放置10～15 min后終止反應，用酶標儀檢測492 nm 波段的吸光值，并對所得數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。每個樣品重復3孔。

1.6 真核載體的構建、轉染及共定位觀察

為探究雞Ii是否能與小鼠MHCⅡ類分子結合，本試驗還用含雞Ii基因的重組真核表達質粒pmCherry-C1-Ii，以及含增強型綠色熒光蛋白(GFP)和小鼠MHCⅡα鏈、β鏈的pEGFP-MHCⅡα和pEGFP-MHCⅡβ的重組真核表達質粒，經LipofectamineTM2000共轉染COS7細胞[14]，轉染48 h后置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)下，觀察雞Ii與小鼠MHCⅡα、β鏈的共定位情況。

2 結果與分析

2.1 Ii功能片段-抗原肽嵌合體的鑒定

圖2顯示，嵌合體的PCR擴增獲得了710 bp的Ii、692 bp的Ii-F2、374 bp的Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、300 bp的Tm/Ii-key/F2/AP、152 bp的Ii-key/F2/AP、146 bp的Ii-key/F2、128 bp的F2，重組質粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、 pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2和pET-32a-F2經BamHⅠ/SalⅠ雙酶切，均獲得了預期長度的目的片段。測序結果顯示，所有克隆的DNA序列與模板序列一致。該結果表明，本試驗成功地構建了Ii功能片段的嵌合體。

2.2 嵌合體融合蛋白的純化

對純化的嵌合體融合蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測。圖3結果顯示，在44.7(His-Ii-F2)，33.2(His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP)，29.2(His-Tm/Ii-key/F2/AP)，24.4(His-Ii-key/F2/AP)，24.0(His-Ii-key/F2)和23.8(His-F2)ku處有相應的目的條帶，大小與預期結果相符。

2.3 Ii功能片段誘導的抗體水平

用pGEX-4T-1-F2重組質粒表達的帶GST標簽的GST-F2融合蛋白作為包被抗原，經間接ELISA檢測，結果(圖4)顯示，對照組小鼠抗F2抗體效價約為(0.7±0.06)×104，而Ii-key/F2、Ii-key/F2/AP、Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、Tm/Ii-key/F2/AP和Ii-F2融合蛋白免疫組抗F2的抗體水平為1.2×104～2.2×104，分別為對照組的1.5，2.5，3，3和3倍。這表明以雞Ii功能片段為載體構建的嵌合體在小鼠體內均具有不同程度的免疫增強作用。

圖2 嵌合體的PCR擴增及其重組質粒的BamHⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定

圖3 純化后嵌合體融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

2.4 雞Ii與小鼠MHCⅡ類分子的共定位

激光共聚焦顯微鏡觀察結果(圖5)表明，在細胞相同位置共定位的蛋白分子會形成橙色熒光。該結果說明，雞Ii與鼠MHCⅡ類分子能在細胞膜上共定位，表示兩者具有相互作用。

3 討 論

MHCⅡ類分子的多態(tài)性是動物與病原長期選擇的結果，MHCⅡ分子與抗原肽之間的親和力大小與抗原遞呈效應密切相關[17]。Ii作為MHCⅡ分子的重要伴侶，在其遞呈抗原過程中起重要的輔助作用。Kim等[18]用人乳突淋瘤病毒(Human papilloma virus，HPV-16)抗原肽E6、E7連接Ii共免疫小鼠，增強了特異性CD8+T淋巴細胞的免疫應答，提高了小鼠存活期。Zinckgraf等[19]用禽流感病毒H5N1的HA抗原表位與人Ii-key連接后對志愿者免疫，發(fā)現(xiàn)其免疫效果較單一抗原免疫增強了3～10倍。Voutsas等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Ii-Key/HER-2/neu 776-790aa嵌合體多肽能夠誘導促進細胞增殖并增強CD4+T淋巴細胞的應答，還能明顯增強特異性CD8+T淋巴細胞的細胞毒作用[21]，而且特異性抗體水平也有明顯提高[22]。

圖5 雞Ii與小鼠MHCⅡ類分子在COS7細胞中的共定位

雞恒定鏈與人和小鼠等哺乳動物Ii存在約60%的同源性，主要的功能區(qū)序列保守。本研究通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，雞的Ii能夠與小鼠MHCⅡα或β鏈在COS7細胞內共定位，并且經過體內試驗證明，用雞Ii-key及其活性片段攜帶抗原肽免疫小鼠能夠增強特異性體液免疫應答水平。對于免疫增強的效果，各個功能片段所起的作用并不相同：雞恒定鏈CLIP區(qū)N端的Ii-key結構能夠促進抗原肽與MHCⅡ分子的結合，而N端的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和C端的AP結構均能起到輔助作用，可進一步增強免疫效果。此外，有研究還表明，鵪鶉Ii與雞和小鼠的MHCⅡα或β鏈也存在跨越種間的相互作用[23]。上述結果表明，盡管禽類與哺乳動物Ii之間存在序列上的差異，但是作為MHCⅡ分子伴侶的Ii，在禽類與哺乳動物中均維持相似的功能特性，而且異種Ii可以跨越物種限制。此外，Ii具有可連接多種抗原肽的潛力，并且可以不使用免疫佐劑[2]，這為Ii成為跨物種抗原肽載體的結構基礎提供了依據。但是不同物種，如哺乳動物與禽類的Ii，尤其是Ii-key氨基酸序列存在明顯不同，選擇何種Ii功能片段作為免疫載體最為有效，還有待于進一步研究。

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