蔡 欣，澤讓東科，趙芳芳，孫 磊

(1 西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽 621010;2 西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

我國牦牛的數(shù)量和類群居世界之冠，約占世界牦?？倲?shù)的95%以上[1]。多年以來，牦牛的育種工作由于種種原因裹足不前，而缺乏可靠穩(wěn)定的分子遺傳標記是重要的原因之一。微衛(wèi)星(Microsatelite)已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳研究、生物遺傳作圖、個體間親緣關(guān)系鑒定等方面，但是目前尚未見將牦牛自身基因組微衛(wèi)星標記應(yīng)用于牦牛群體遺傳的報道，研究人員只能利用普通牛的微衛(wèi)星序列分析牦牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)分類[2-5]。由于普通牛與牦牛分屬于不同的物種，其基因組內(nèi)功能基因編碼序列常存在明顯的不同，微衛(wèi)星序列應(yīng)該亦存在較大差別，所以以普通?；蚪M微衛(wèi)星研究牦牛群體或個體之間的遺傳多態(tài)性，不僅難度較大，而且研究結(jié)果的準確性和可重復(fù)性應(yīng)該遠遠低于用牦牛自身基因組微衛(wèi)星的研究結(jié)果。本課題組通過Dynal磁珠富集從牦?；蚪M中分離出59個具有(AC)n/(GT)n串聯(lián)重復(fù)序列的微衛(wèi)星位點，將為牦牛遺傳多態(tài)性研究、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建以及分子育種提供一些分子標記[6]。本研究進一步利用其中多態(tài)性較好的4個新微衛(wèi)星位點對麥洼牦牛群體的遺傳多態(tài)性進行分析，以期為麥洼牦牛遺傳分化特征研究和遺傳資源挖掘提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從四川省紅原縣麥洼牦牛原種群繁育基地和當?shù)赝涝讏鲋须S機選取130頭個體作為研究對象，采取每個個體的靜脈血、耳組織塊或毛發(fā)樣品，處理后低溫送回實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 牦?；蚪MDNA的提取 麥洼牦牛血液基因組DNA按照Cai等[7]所用方法提取，耳組織和毛發(fā)樣品基因組DNA按照常規(guī)的“鹽析法”進行提取，確保高純度且無蛋白和RNA污染，選擇提取質(zhì)量較好個體的DNA樣品用作微衛(wèi)星擴增模板。

1.2.2 微衛(wèi)星標記 4個新的微衛(wèi)星標記(Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215)的核心重復(fù)序列、PCR擴增引物以及退火溫度如表 1所示。

表1 4個微衛(wèi)星位點的基本信息

通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由北京梓熙生物科技有限公司合成，Bogr203、Bogr204和Bogr215位點PCR擴增上游引物5′端均用FAM熒光染料標記，而Bogr205位點PCR引物5′端用HEX熒光染料標記。

1.2.3 微衛(wèi)星標記的PCR擴增 以上述130個牦牛個體基因組DNA為模板，對各個位點分別進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中10×Buffer (Mg2+free) 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4 μL，微衛(wèi)星位點擴增上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶 (5 U/μL) 1.25 μL，模板DNA 1 μL，超純滅菌水12.75 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃/59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，12 ℃終止。將PCR擴增產(chǎn)物直接送往北京擎科生物公司通過ABI3730測序儀進行基因分型，使用GeneMapper v3.2 軟件分析各樣本等位基因數(shù)及其等位基因片段的長度。

1.3 遺傳多態(tài)性和群體遺傳分化分析

每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(N)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和平均多態(tài)信息含量(PIC)通過Cervus 2.0 軟件計算獲得[8]。使用Structure Version 2.2軟件[9]基于混合模型對牦牛群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。預(yù)設(shè)群體分化數(shù)目(K值)為2～5，將馬爾可夫鏈(Markov chain)開始時的迭代次數(shù)設(shè)為110 000次，刪除前10 000 次不作統(tǒng)計，每個K值重復(fù)運行5 次。若似然值隨著預(yù)設(shè)K值的增大而增大，則按Evanno等[10]提出的用ΔK來確定合適的K值，并推斷牦牛群體中的亞群數(shù)，構(gòu)建群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微衛(wèi)星位點的基因分型

4個微衛(wèi)星位點在130頭麥洼牦牛個體的基因分型結(jié)果如表2所示。由表2可知，Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215位點分別有7，5，8和8個等位基因，4個微衛(wèi)星位點的平均等位基因數(shù)為7；Bogr204位點的等位基因片段相對較小，為153～164 bp，而其余3個位點等位基因片段長度在226～261 bp。

表2 麥洼牦牛群體在4個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性

2.2 麥洼牦牛群體的遺傳多態(tài)性

由表2可知，麥洼牦牛群體在4個微衛(wèi)星位點的平均觀察雜合度(Ho) 為0.626，其值為0.521～0.780；平均期望雜合度(He)為 0.800，其值為 0.761～0.852；平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.751，其值為0.712～0.801。可見麥洼牦牛群體在4個微衛(wèi)星位點均具有較豐富的多態(tài)性。

2.3 麥洼牦牛群體的遺傳結(jié)構(gòu)

通過Structure Version 2.2軟件對麥洼牦牛群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，并根據(jù)Evanno等[10]提出的方法推斷麥洼牦牛的亞群數(shù)，結(jié)果(圖1)表明，當群體分化數(shù)目K=2時，群體遺傳結(jié)構(gòu)圖中出現(xiàn)穩(wěn)定的亞群；而當K=3、K=4或K=5時，群體遺傳結(jié)構(gòu)圖中亞群的分化呈現(xiàn)出不穩(wěn)定和較混亂的狀態(tài)?？梢姡溚蓐笈Ｈ后w存在較明顯的群體遺傳分化特征，作為著名牦牛品種的麥洼牦?？赡芊只癁橹辽?個亞群。

圖1 130頭麥洼牦牛個體在4個微衛(wèi)星位點的Structure群體結(jié)構(gòu)

3 討 論

麥洼牦牛是生活在我國四川西北高寒草地的優(yōu)良地方牦牛品種，主要分布在阿壩州的紅原、若爾蓋、阿壩、松潘、壤塘及甘肅甘南州的瑪曲等地，現(xiàn)存欄90余萬頭。由于分布區(qū)域廣、數(shù)量多，因此麥洼牦牛品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)可能復(fù)雜而多樣。但是，目前關(guān)于牦牛群體遺傳的研究全部限于不同牦牛品種(類群)之間系統(tǒng)進化關(guān)系的分析探討，且選用的遺傳標記為mtDNA序列，而關(guān)于各個牦牛品種(類群)內(nèi)部遺傳分化特征的研究尚未開展[11-13]。

微衛(wèi)星DNA分子標記具有分布廣且均勻、多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、選擇中性等特點，已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳研究。本課題組通過Dynal磁珠富集從牦?；蚪M中分離出大量微衛(wèi)星標記[5]，從中篩選出多態(tài)性較好的4個新的微衛(wèi)星位點，對麥洼牦牛群體遺傳多態(tài)性進行了分析。結(jié)果表明，麥洼牦牛品種在4個新微衛(wèi)星位點共有28個等位基因，而Qi等[14]運用3個普通牛微衛(wèi)星標記在麥洼牦牛中只檢測到8個等位基因，因此在PCR擴增中，相對普通牛微衛(wèi)星引物，牦牛自身基因組的微衛(wèi)星引物與牦牛基因組模板具有更高的結(jié)合力。雖然麥洼牦牛群體在4個新微衛(wèi)星位點具有較高的遺傳多態(tài)性，平均觀察雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和平均多態(tài)信息含量(PIC)分別達到0.626，0.800和0.751，但是由于微衛(wèi)星位點數(shù)量少而提供的遺傳多態(tài)性信息量仍較為有限，后續(xù)研究還需要分離鑒定更多的高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點用于分析麥洼牦牛群體的分化特征。

通過Structure軟件能夠較明確地將麥洼牦牛群體區(qū)分為2個亞群，這與麥洼牦牛分布地域廣泛有較大關(guān)系。本研究選取的部分牦牛個體來自紅原縣麥洼牦牛原種場，部分來自屠宰場，而屠宰場的牦?？赡軄碜约t原周邊的若爾蓋、阿壩、松潘和壤塘等縣。但是本研究劃分的2個亞群中究竟包含了哪些個體，分別來自哪些區(qū)域，由于獲得的樣品缺乏準確記錄而無法確定。所以，對于不同地域的麥洼牦牛群體的遺傳特征尚需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 鐘金城,陳志華,馬志杰,等.牦牛分子育種的理論與實踐 [J].西南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2006,32(1):114-119.

Zhong J C,Chen Z H,Ma Z J,et al.Theory and practice on yak molecular breeding [J].Journal of Southwest University for Nationalities:Natural Science Edition,2006,32 (1):114-119.(in Chinese)

[2] Nguyen T T,Genini S,Menetrey F,et al.Application of bovine microsatellite markers for genetic diversity analysis of Swiss yak (Poephagusgrunniens) [J].Anim Genet,2005,36(6):484-489.

[3] Qi X B,Han J L,Lkhagya B,et al.Genetic diversity and differentiation of Mongolian and Russian yak populations [J].J Anim Breed Genet,2005,122(2):117-126.

[4] 廖信軍,常 洪,張貴香,等.中國五個地方牦牛品種遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析 [J].生物多樣性,2008,16(2):156-165.

Liao X J,Chang H,Zhang G X,et al.Genetic diversity of five native Chinese yak breeds based on microsatellite DNA markers [J].Biodiversity Science,2008,16(2):156-165.(in Chinese)

[5] 鐘金城,陳志華,趙素君,等.牦牛生態(tài)類型的分類 [J].生態(tài)學(xué)報,2006,26(7):9601-9605.

Zhong J C,Chen Z H,Zhao S J,et al.Classification of ecological types of the Chinese yak [J].Acta Ecologica Sinica,2006,26(7):9601-9605.(in Chinese)

[6] 蔡 欣,澤讓東科,張修月,等.牦?；蚪M串聯(lián)重復(fù)序列(AC)n/(GT)n的分離 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2012,32(9):1289-1294.

Cai X,Mipam T D,Zhang X Y,et al.Isolation of simple tandem repeats (AC)n/(GT)nfrom the genome of Yak [J].Chinese Journal of Veterinary Sciences,2012,32(9):1289-1294.(in Chinese)

[7] Cai X,Chen H,Lei C Z,et al.mtDNA diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos taurus and Bos indicus in China [J].Genetica,2007,131(2):175-183.

[8] Kalinowski S T,Taper M L,Marshall T C.Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment [J].Mol Ecol,2007,16(5):1099-1106.

[9] Pritchard J K,Stephens M,Donnelly P.Inference of population structure using multilocus genotype data [J].Genetics,2000,155(2):945-959.

[10] Evanno G,Regnaut S,Goudet J.Detecting the number of clusters of individuals using the software Structure:A simulation study [J].Mol Ecol,2005,14(8):2611-2620.

[11] Guo S,Savolainen P,Su J,et al.Origin of mitochondrial DNA diversity of domestic yaks [J].BMC Evol Biol,2006,22(6):73.

[12] Lai S J,Chen S Y,Liu Y P,et al.Mitochondrial DNA sequence diversity and origin of Chinese domestic yak [J].Anim Genet,2007,38(1):77-80.

[13] Wang Z F,Shen X,Liu B,et al.Phylogeographical analyses of domestic and wild yaks based on mitochondrial DNA:New data and reappraisal [J].J Biogeogr,2010,37(12):2332-2344.

[14] Qi X B,Han J L,Wang G,et al.Assessment of cattle genetic introgression into domestic yak populations using mitochondrial and microsatellite DNA markers [J].Anim Genet,2010,41(3):242-252.