喬建援，趙 峰，齊笑飛，孫沛勇，杜風光

(河南天冠企業(yè)集團有限公司 試驗中心，河南 南陽473000)

0 引言

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，以下簡稱PDO)是一種重要的精細化工原料，主要用作合成聚酯和聚氨酯的單體等［1］． 近幾年的研究表明，以PDO 為單體合成的對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)具有優(yōu)良的加工、染色等性能［2］，可以廣泛地應用于紡織工業(yè)．最近十幾年國際市場上甘油的生產(chǎn)過剩，也促進了甘油生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)PDO 的研究．和化學法相比，微生物轉(zhuǎn)化法具有安全、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展性，特別是隨著石化資源的日益枯竭，生物基化學品的研究不斷升溫，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)PDO 已成為研究的熱點［3-4］．

陶春平等研究表明［5］:培養(yǎng)基中氮濃度較低時，菌體生長和產(chǎn)物生成都會因氮源不足受到影響;氮源濃度較高時會導致菌體過度生長和副產(chǎn)物的大量生成，降低PDO 的最終濃度以及甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率． 筆者在進行產(chǎn)業(yè)化評估時發(fā)現(xiàn)，以目前的培養(yǎng)基配方來進行產(chǎn)業(yè)化，不僅成本高，而且在氮源的添加方面沒有一個較好的控制方式，這必將制約PDO 的產(chǎn)業(yè)化．

筆者從培養(yǎng)基成本及氮源的控制角度出發(fā)，研究了3 種不同的有機氮源、無機氮源用量情況以及不同的補加方式下對發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的影響．

1 實驗部分

1．1 菌株與培養(yǎng)基

克雷伯氏肺炎桿菌:河南天冠企業(yè)集團有限公司車用燃料生物技術(shù)國家重點試驗室保存．

種子培養(yǎng)基(g/L)［6］:K2HPO4·3H2O 7．0，(NH4)2SO44．0，KH2PO42．0，MgCl2·6H2O 0．1，酵母浸粉1．0，微量元素液0．3 mL，pH 值7．0．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):K2HPO4·3H2O 6． 8，NaH2PO4·2H2O 1．38，(NH4)2SO43．5，MgSO4·7H2O 0．26，酵母浸粉1．0，微量元素液0．3 mL，pH 值7．0．

1．2 試劑和儀器

化學試劑均為市購，分析純;酵母浸粉為安琪FM801;玉米漿粉為上海西王淀粉糖有限公司產(chǎn)品;全脂黃豆粉為本地黃豆經(jīng)粉碎而成．

全自動發(fā)酵罐為上海國強生化裝備有限公司出產(chǎn)．搖床采用上海智誠ZHWY -2112C 型． pH監(jiān)測采用Mettler Inpro2000 型電極，M400 變送器．

1．3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)條件:三角瓶裝液量50 mL/250 mL，搖床培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速175 r/min ，培養(yǎng)時間12 h．

發(fā)酵采用50 L 全自動發(fā)酵罐，初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積35 L，接種量1%(質(zhì)量分數(shù))，初始甘油濃度25 g/L，發(fā)酵液pH 值6． 3，發(fā)酵溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，風量為0．56 Nm3/h． 采用2 mol/L 的氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程中pH 值，過程流加甘油，發(fā)酵時間48 h．

1．4 分析方法

1．4．1 生物量

生物量通過測定發(fā)酵液在650 nm 下的吸光度值轉(zhuǎn)換所得．分光光度計采用Unico722 型．

1．4．2 化學成分的測定

甘油、PDO 及副產(chǎn)物中的有機酸［7］采用高效液相色譜法測定．高效液相色譜為安捷倫1200．

1．4．3 氨氮的測定方法

氨氮的測定采用HJ 535—2009［8］中的碘化汞-碘化鉀-氫氧化鈉法測定，添加酒石酸鈉鉀來消除金屬離子的影響． 分光光度計采用Unico722 型．

2 結(jié)果與討論

2．1 初始氮用量對PDO 生物合成的影響

通過試驗發(fā)現(xiàn)，如果降低初始氮用量，會延長菌體的對數(shù)生長期，且PDO 的最終含量也較高．因此，選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基中初始氮用量的50%、75%、100%(質(zhì)量比)為條件，保持3 種條件下發(fā)酵全過程總氮用量相同，研究了初始氮用量對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖1 所示．

圖1 不同的初始氮用量對發(fā)酵的影響Fig．1 Effects of different initial nitrogen content in the fermentation

由圖1 可知，當初始氮用量過低時，PDO 合成明顯放慢，且操作中，補氮時間明顯提前，在9 h左右就必須補入氮源，補氮后菌濃出現(xiàn)了快速提升．由于菌體處于亞健康狀態(tài)，50%的初始氮用量下的最終PDO 的合成遠低于另兩種方式．而初始氮用量100%的條件下，菌體的增長明顯較快，但PDO 的增長低于75%的狀態(tài)．

同時測量了不同初始氮用量下的培養(yǎng)基在消毒前后的氨氮含量，如表1 所示． 從表1 可以看出，起始氮源用量高時，氨氮的損失也大，消毒后培養(yǎng)基的顏色也較深．因此認為，消毒時在高溫的作用下氨氮與培養(yǎng)基中的糖分發(fā)生美拉德反應，從而損失了部分氨氮，產(chǎn)生了氨基糖，造成了發(fā)酵液顏色加深．

表1 不同初始氮用量下氮源的損失率Tab．1 The nitrogen loss rate of different initial nitrogen by disinfection treatment

2．2 純無機氮對PDO 生物合成的影響

在做學術(shù)研究時，試驗方案中可以采用優(yōu)質(zhì)的氮源為原料，但大生產(chǎn)中高成本將是一個新產(chǎn)品進入市場的關(guān)鍵制約因素．因此，筆者試驗了純無機氮源對PDO 生物合成的影響，結(jié)果如圖2 所示．

圖2 純無機氮源對PDO 生物合成的影響Fig．2 Effects of pure inorganic nitrogen sources on PDO biosynthesis

試驗組選用了初始氮用量的75%，兩次間隙補加無機氮源，保持總氮用量不變，對照組也為初始氮用量的75%． 圖2 的對比試驗表明，純無機氮對菌體生長基本沒有影響，但PDO 合成速度低，且合成滯后，發(fā)酵終了PDO 的含量低．表明純無機氮無法提供產(chǎn)物合成用的一些微量生物因子．

2．3 有機氮對PDO 生物合成的影響

針對工業(yè)中常使用的幾種有機氮源，筆者選用安琪酵母浸粉、西王玉米漿粉、全脂黃豆粉等3 種有機氮源進行了對比試驗，試驗結(jié)果如圖3 所示．

圖3 等量有機氮下對發(fā)酵的影響Fig．3 Effect on Fermentation of equal amount of organic nitrogen

試驗表明，相同用量下后兩者比酵母浸粉差．因此，筆者對不同氮源的添加量進行了優(yōu)化，結(jié)果如圖4 所示．通過優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)，3．0 g/L 玉米漿粉、2．5 g/L 的全脂黃豆粉與1．0 g/L 酵母浸粉的PDO 生物合成結(jié)果相當．但全脂黃豆粉雖提供了充足的有機物，卻在發(fā)酵中產(chǎn)生了大量的泡沫，對發(fā)酵的影響較大，因此，玉米漿粉是PDO 產(chǎn)業(yè)化中的最佳選擇．

圖4 優(yōu)化后不同有機氮對發(fā)酵的影響Fig．4 Effect of different organic nitrogen on fermentation after optimizing

2．4 補加方式對PDO 生物合成的影響

為了分析氮源濃度對發(fā)酵的影響，筆者試驗了3 種補加方式:二次間隙補料、連續(xù)穩(wěn)定的補加、與pH 值耦合補加，試驗結(jié)果如圖3 所示． 試驗表明:常用的二次間隙補料存在著氨氮濃度的起伏，對菌株的生長不利;而連續(xù)穩(wěn)定的補加方式，在發(fā)酵中前期發(fā)酵液氨氮含量會逐漸下降，使PDO 合成較慢，而后期最終發(fā)酵液中氨氮含量的增加，不利于廢水的處理．

隨后筆者選用了與pH 值調(diào)控耦合的補加方式，分析了發(fā)酵過程pH 值與氮源消耗的變化規(guī)律．該補加方式前期主要產(chǎn)乙酸，乙酸有利于PDO 的生成［9］，此時氮源消耗隨堿液消耗的增大而增大，后期產(chǎn)乳酸，氮源消耗與堿液消耗基本沒有關(guān)系．因此，筆者選擇了前24 h 與pH 值的調(diào)控耦合補加氮源，而后期停止補加的方式，并取得較好的發(fā)酵結(jié)果，試驗結(jié)果如圖5．

圖5 3 種補加方式下氨氮的變化曲線Fig．5 Variation curves of ammonia nitrogen in three feeding mode

圖6 3 種補加方式的發(fā)酵的影響Fig．6 Effects of three kinds of adding method in fermentation

試驗表明:連續(xù)補加有利于氨氮含量的穩(wěn)定，對菌株生長及PDO 生物合成有利;而與pH 值調(diào)控相耦合的補加方式，更有利于發(fā)酵料中氨氮含量的穩(wěn)定，有利于大生產(chǎn)中的操控．試驗證明，采用與pH 值調(diào)控相耦合的方式，PDO 的最終含量提高到72．5 g/L．

3 結(jié)論

(1)本試驗表明，純有機氮只能提供菌株生長需要的氮源，但無法提高PDO 的產(chǎn)量，說明必要的有機氮源添加是促進PDO 生物合成的有效方式．

(2)初始氮含量的控制不僅有效地減少氮源的損失，而且能促進菌株轉(zhuǎn)化甘油為PDO，提高最終發(fā)酵液中PDO 的含量．氮源與糖類物質(zhì)的美拉德反應所產(chǎn)生的物質(zhì)是否會阻礙菌株合成PDO 仍有待研究．

(3)3．0 g/L 的玉米漿粉與1．0 g/L 的酵母浸粉均能有效地促進甘油轉(zhuǎn)化為PDO．說明玉米漿粉可以成為工業(yè)大生產(chǎn)中的有機氮源，從而降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本．

(4)氮源的補加方式是PDO 生物合成的一個重要的影響因子，控制穩(wěn)定的氮源濃度使得PDO的生物合成可以得到顯著的提高． 采用與pH 值調(diào)控相耦合的補加方式能有效地穩(wěn)定發(fā)酵液中的氮源濃度，使PDO 的最終含量達到72．5 g/L．

［1］ 劉德華，劉宏娟，程可可． 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇研究進展［J］．合成纖維，2005，(6):11 -15．

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［9］ 張延平． 1，3-丙二醇生物合成過程中的輔因子代謝調(diào)控［D］．北京:清華大學化工學院，2006．