劉春葉，王　拓，程傳栩，聶太雷

(西安醫(yī)學院藥學院,陜西 西安710021)

赤芍是毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)的干燥根，呈圓柱形，稍彎曲，氣微香，味微苦、酸澀[1]，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效。

微波萃取是利用微波快速加熱的特性，并結合傳統(tǒng)溶劑提取法而發(fā)展的一種針對固體樣品的新萃取技術。與傳統(tǒng)中草藥提取方法相比，微波萃取具有浸提時間短、效率高、加熱均勻、安全環(huán)保等特點[2-5]。

響應曲面法(RSM)是數學方法和統(tǒng)計方法結合的產物，可用來對響應值受多個變量影響的問題進行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化該響應值[6]。采用響應曲面法可以建立連續(xù)變量曲面模型，對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平范圍。

目前，關于微波輔助提取赤芍活性成分的研究尚未見文獻報道。作者擬建立赤芍活性成分的微波輔助提取法，并采用單因素實驗與響應曲面法對提取條件進行優(yōu)化，為更好地對赤芍活性成分進行提取、評價其藥用價值提供幫助。

1　實驗

1.1　材料與儀器

赤芍藥材(產地安徽、甘肅、陜西)，購自西安市萬壽路中藥材市場，經西安醫(yī)學院生藥教研室張寒老師鑒定符合藥典質量標準。將赤芍在40 ℃下烘干，粉碎，過40目篩，得赤芍粉。

FW-200型萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Beckman P/ACE MDQ型毛細管電泳儀，中國貝克曼庫爾特商貿有限公司北京分公司；標準40目檢驗篩，上虞大亨橋化驗儀器廠；CMD-20X型恒溫鼓風干燥箱，上?，槴\實驗設備有限公司；XH-300A型電腦微波超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；RE-200A型旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責任公司；Anke TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司。

1.2　提取方法

為了保證實驗效果和藥材的合理利用，經過預實驗計算，每次實驗所用赤芍粉為1.0 g。

稱取1.0 g赤芍粉置于250 mL圓底三頸燒瓶中，加入溶劑，在一定的微波功率、提取溫度、提取時間、液料比下進行微波輔助提取，補重，濃縮提取液，定容，在200～400 nm范圍內進行紫外掃描，以最大吸收波長處的吸光度作為評價指標進行提取效果對比。

1.3　毛細管電泳條件

采用75μm內徑熔融石英毛細管柱(總長65 cm，有效長度60 cm)；分離電壓20 kV；壓力進樣：0.5 psi×5 s，正極端進樣，陰極端檢測；分離溫度25 ℃；檢測波長260 nm；由Beckman P/ACE工作軟件進行數據處理。

2　結果與討論

2.1　單因素實驗結果

2.1.1提取溫度對提取效果的影響

固定液料比40∶1(mL∶g，下同)、提取時間20 min、微波功率1 000 W，考察提取溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)對提取效果的影響，結果見圖1。

圖1　提取溫度對提取效果的影響

由圖1可以看出，隨著提取溫度的升高，提取量先升高后降低，在80 ℃達到最高。這可能是因為，在一定的范圍內，隨著提取溫度的升高，提取物在溶劑中的溶解度增大，提取量相應升高；但當提取溫度過高時，溶劑部分揮發(fā)導致提取量降低；另一方面，當提取溫度過高時，赤芍活性成分發(fā)生部分水解，由水溶性變成脂溶性，導致其在水中的溶解度變小，吸光度減小，提取量降低。

2.1.2液料比對提取效果的影響

固定提取溫度80 ℃、提取時間20 min、微波功率1 000 W，考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1)對提取效果的影響，結果見圖2。

由圖2可以看出，在液料比為70∶1時，提取量達到最高。這可能是因為，當液料比較小時，溶出的活性成分較少；當液料比增大到一定值后，可以將赤芍活性成分充分溶出，此時提取液中的活性成分含量最多；當液料比繼續(xù)增大，活性成分不再溶出，提取量不再升高。

圖2　液料比對提取效果的影響

2.1.3提取時間對提取效果的影響

固定提取溫度80 ℃、液料比70∶1、微波功率1 000 W，考察提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min)對提取效果的影響，結果見圖3。

圖3　提取時間對提取效果的影響

由圖3可以看出，在提取時間為70 min時，提取量達到最高。這可能是因為，提取時間越長，赤芍活性成分在水中溶解量越多；提取一定時間后，赤芍活性成分向溶劑中的擴散速率與藥物殘渣對活性成分的吸附速率相等，提取液達到最大濃度，此時吸光度達到最大值，提取量達到最高。

2.2　響應曲面法實驗結果

2.2.1Box-Behnken設計

在單因素實驗的基礎上，通過響應曲面法進行微波輔助提取赤芍活性成分的條件優(yōu)化。Box-Behnken設計因素水平見表1，響應曲面法實驗結果見表2，回歸分析見表3。

表1　Box-Behnken 設計因素水平表

表2　響應曲面法實驗結果

由表2得到相應的二次模型方程：Y=0.26+0.022A-0.001266B+0.008747C+0.014AB+0.007683AC+0.0001690BC+0.007036A2-0.013B2-0.009223C2。

由表3可知，二次模型的P值為0.03575，表明該模型顯著；因素A的P值為0.0343，表明提取溫度對提取效果影響顯著。

根據響應曲面得出的等高線和曲面圖分析各個因素之間的相互交叉影響。等高線的投影越接近橢圓，三維曲面圖越陡峭、最高點越突出，說明該因素對應變量的影響越顯著，其P值越小，方程中的絕對值越大。P值小于0.05的可以認為是有交互作用，曲面顏色的深淺則表示該區(qū)域實驗組合的優(yōu)劣[7]。

提取溫度、提取時間、液料比之間的交互作用見圖4。

表3　回歸分析結果

由圖4a可看出，當液料比(C)為70∶1時，等高線橢圓效果不好，提取溫度和提取時間的交互作用不明顯，與表3結果一致(AB兩者的P值為0.2865>0.05，無交互作用)。

由圖4b可看出，當提取時間(B)為70 min時，等高線橢圓效果不好，兩者交互作用不明顯，與表3結果一致(AC兩者的P值為0.5385>0.05，無交互作用)。

由圖4c可看出，當提取溫度(A)為80 ℃時，等高線接近于圓，交互作用不明顯，與表3結果一致(BC兩者的P值為0.9890>0.05，無交互作用)。

采用Design Expert 8.0.6軟件進行數據處理，確定赤芍活性成分的最優(yōu)提取條件為：提取溫度89.99 ℃、提取時間75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此時，赤芍水提液的吸光度預測值為0.3022，實測值為0.2899。表明該模型預測效果良好。

2.3　毛細管電泳分離檢測

在最優(yōu)條件下微波輔助提取赤芍活性成分，采用毛細管電泳法進行分離檢測，結果見圖5。

由圖5可見，赤芍水提液中所含組分相對較少。

2.4　不同產地赤芍活性成分的差異分析

在最優(yōu)提取條件下，分別對安徽、甘肅、陜西3個產地的赤芍活性成分進行含量分析。將各水提液在200～400 nm進行紫外掃描，根據最大吸收波長處的吸光度大小判斷不同產地赤芍活性成分的含量差異，結果見圖6。

圖4　提取溫度、提取時間、液料比之間的交互作用

圖5　赤芍水提液的毛細管電泳圖譜

由圖6可看出，陜西產赤芍水提液活性成分的含量稍大于甘肅和安徽，安徽和甘肅產赤芍水提液的活性成分含量接近。表明不同產地赤芍的活性成分含量存在一定的差異。

3　結論

以水為溶劑，采用微波輔助提取法對赤芍活性成分進行提取。通過單因素實驗、Box-Behnken 設計和響應曲面法，借助Design Expert 8.0.6 軟件，對赤芍活性成分的提取工藝進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)提取條件為：提取溫度89.99 ℃、提取時間75.32 min、液料比79.25∶1(mL∶g)，此時，赤芍水提液的吸光度預測值為0.3022，實測值為0.2899。該方法預測效果良好，可為中藥活性成分的微波輔助提取提供參考。

圖6　不同產地赤芍水提液的紫外吸收光譜

參考文獻：

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[3]馮年平，郁威.中草藥提取分離技術原理與應用[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:340-350.

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