史建龍，羅云敬，崔　爽，葉三仙，魯　緋

(1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.北京市食品與釀酒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)一站，北京 100075)

纖維蛋白原是人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)凝血、炎癥及組織修復(fù)功能的大分子糖蛋白，由3對(duì)非等同的多肽鏈α2β2γ2形成六聚體[1-2]。纖維蛋白原的損傷能夠增大血液黏滯度和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的堆積、加速動(dòng)脈粥樣硬化及其它心血管疾病的形成和發(fā)展[3-4]。纖維蛋白原的氧化會(huì)導(dǎo)致其α鏈間酪氨酸發(fā)生交聯(lián)[5]，金屬離子誘導(dǎo)的纖維蛋白原氧化修飾能誘發(fā)血纖維蛋白原異常癥，抑制血栓的形成[6-7]。

過(guò)氧亞硝酸根(ONOO-)是人體內(nèi)一種強(qiáng)氧化硝化細(xì)胞毒性物質(zhì)，能夠引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[8]，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，引起一系列生理病理過(guò)程，最終導(dǎo)致癌癥[9]、帕金森癥、中風(fēng)以及心血管疾病[10]。研究發(fā)現(xiàn)，一些金屬離子如Co(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)能夠催化ONOO-介導(dǎo)的纖維蛋白原硝化反應(yīng)[11-12]。銅作為人體必需的微量元素，參與多種金屬酶的構(gòu)成，催化心血管基質(zhì)膠原蛋白的合成，對(duì)于維持心血管功能及凝血功能具有重要作用。

鑒于此，作者對(duì)Cu(Ⅱ)參與的ONOO-硝化損傷纖維蛋白原過(guò)程進(jìn)行研究，采用衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)、SDS-PAGE電泳和馮克勞斯(Von Clauss)法對(duì)該過(guò)程中纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)以及凝聚活性的變化進(jìn)行了分析。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　試劑與儀器

纖維蛋白原、凝血酶，美國(guó)Sigma公司；蛋白Marker(board)，北京鼎國(guó)；ONOO-溶液，根據(jù)Uppu等[13]提出的兩相反應(yīng)體系制備，-20 ℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用紫外分光光度計(jì)在302 nm處測(cè)定其吸光度，并根據(jù)ε302=1 670 L·mol-1·cm-1計(jì)算ONOO-濃度；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

U3010型紫外分光光度計(jì)，日本日立公司；Vertex70型傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；J-KEM型平行合成儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；DYY-12C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2　纖維蛋白原的硝化

將纖維蛋白原溶于0.5 mol·L-1、pH值為7.4的Tris-HCl(含0.15 mol·L-1NaCl)緩沖溶液中。在比色管中分別加入3 mL濃度為3 mg·mL-1的纖維蛋白原溶液，然后加入不同量濃度為100 mmol·L-1的CuSO4溶液，使體系中Cu(Ⅱ)的終濃度(mmol·L-1)分別為0.00、0.17、0.30、0.50、0.67、0.83和1.66,37 ℃孵育5 min。將ONOO-以0.018 mmol·L-1·min-1的恒定速率注入到不斷攪拌的纖維蛋白原溶液中，37 ℃孵育30 min。

1.3　Cu(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化的影響

1.3.1二級(jí)結(jié)構(gòu)變化實(shí)驗(yàn)

將上述硝化后的纖維蛋白原溶液均勻地鋪滿(mǎn)ATR的ZeSe晶片，在4 cm-1分辨率、室溫敞開(kāi)狀態(tài)下，掃描2 048次，采集紅外光譜。

同法采集纖維蛋白原溶液和緩沖溶液的紅外光譜。用纖維蛋白原溶液的紅外譜圖差減緩沖溶液的紅外譜圖，以差減譜圖在2 200～1 800 cm-1呈一條平滑直線(xiàn)作為終點(diǎn)。對(duì)差減譜圖在酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)內(nèi)進(jìn)行兩點(diǎn)基線(xiàn)校正，采用9點(diǎn)Savits Golay函數(shù)平滑后，做二階導(dǎo)數(shù)和傅立葉去卷積。手動(dòng)選定各子峰的峰位和峰寬，采用Gausse函數(shù)進(jìn)行擬合，重復(fù)操作使殘差最小。當(dāng)確定了各子峰與不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

1.3.2凝聚活性變化實(shí)驗(yàn)

將凝血酶溶于0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中，酶活力單位為0.5 U·mL-1。37 ℃孵育5 min后，向硝化后的纖維蛋白原反應(yīng)溶液中以1∶1(體積比)的比例加入凝血酶，用帶鉤的小棒以一定速度上下鉤動(dòng)溶液，當(dāng)出現(xiàn)明顯纖維絲和凝聚塊時(shí)，記錄其凝聚時(shí)間，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次[14]。

1.3.3SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)

對(duì)硝化后的纖維蛋白原溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳條件：采用8％的分離膠和5％的濃縮膠，加樣后，起始電壓設(shè)為80 V，待前沿指示到達(dá)分離膠后將電壓增加到120 V；當(dāng)前沿指示距膠底端約1 cm時(shí)，切斷電源；染色1 h，脫色至背景色完全消失。

2　結(jié)果與討論

2.1　二級(jí)結(jié)構(gòu)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同Cu(Ⅱ)濃度的硝化纖維蛋白原的紅外光譜(圖1)

由圖1可看出，硝化后的纖維蛋白原紅外光譜酰胺Ⅰ帶分別在1 657 cm-1、1 649 cm-1和1 644 cm-1處有吸收峰，酰胺Ⅱ帶在1 551 cm-1處有吸收峰，分別對(duì)應(yīng)α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲。

對(duì)紅外光譜酰胺Ⅰ帶求二階導(dǎo)數(shù)，作平滑處理并進(jìn)行差減，得到硝化纖維蛋白原酰胺Ⅰ帶紅外差減譜圖，如圖2所示。

a～g,Cu(Ⅱ)濃度(mmol·L-1)：0.00，0.17,0.30,0.50,0.67,0.83,1.66

a～g,Cu(Ⅱ)濃度(mmol·L-1)：0.00，0.17,0.30,0.50,0.67,0.83,1.66

由圖2可看出：隨著反應(yīng)體系中Cu(Ⅱ)濃度由0.00 mmol·L-1增大到1.66 mmol·L-1，硝化纖維蛋白原殘基吸光度逐漸增大；二階求導(dǎo)并平滑處理前纖維蛋白原的峰形較平緩，處理后隨著Cu(Ⅱ)濃度的增加峰形越來(lái)越尖銳；酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1 651 cm-1移動(dòng)到了1 652 cm-1。

2.1.2不同濃度的Cu(Ⅱ)對(duì)硝化纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

硝化纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化在一定程度上可以反映ONOO-對(duì)纖維蛋白原的損傷程度。定量分析顯示，天然纖維蛋白原中α-螺旋占38.03％、β-折疊占29.89％、β-轉(zhuǎn)角占12.6％、無(wú)規(guī)卷曲占15.84％，這與Azpiazu等[15]的研究結(jié)果一致。

不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化見(jiàn)圖3。

由圖3可看出：不同濃度的Cu(Ⅱ)對(duì)硝化纖維蛋白原的二級(jí)結(jié)構(gòu)均有影響，但高濃度影響更明顯；隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大，α-螺旋比例逐漸下降，β-折疊比例逐漸上升，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲比例僅發(fā)生較小的變化；當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度達(dá)1.66 mmol·L-1時(shí)，α-螺旋比例由最初的32.29％減少到25.15％，β-折疊比例由35.66％升高到44.47％，β-轉(zhuǎn)角比例由13.01％減少到12.63％，無(wú)規(guī)卷曲比例由15.94％減少到14.19％，α-螺旋和β-折疊變化顯著。

圖3　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

2.2　凝聚活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)

圖4　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的凝聚活性

由圖4可知:硝化纖維蛋白原的凝聚活性隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大不斷降低；當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度≤0.30 mmol·L-1時(shí)，凝聚活性隨著濃度的升高變化幅度較小，成絲時(shí)間稍微延長(zhǎng)，成塊時(shí)間無(wú)明顯變化，此時(shí)的Cu(Ⅱ)對(duì)硝化纖維蛋白原生物學(xué)功能影響較??；當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度≥0.50 mmol·L-1時(shí)，凝聚活性急劇下降，凝聚時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度達(dá)到1.66 mmol·L-1時(shí)，能看到少許細(xì)絲，不能形成凝塊，失去了凝聚活性，喪失了生物學(xué)功能。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，Cu(Ⅱ)本身不能與纖維蛋白原作用。

2.3　不同Cu(Ⅱ)濃度的硝化纖維蛋白原的SDS-PAGE電泳圖譜(圖5)

圖5　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的SDS-PAGE圖譜

由圖5可看出：未處理的纖維蛋白原有3條蛋白帶，自上而下分別為Aα、Bβ和γ[12]；硝化處理后(未添加CuSO4以及添加不同濃度CuSO4)，上述三條蛋白帶無(wú)明顯變化，且位置與未處理纖維蛋白原一致，證明ONOO-硝化方法較溫和，并未引起蛋白肽鏈的降解；但隨著Cu(Ⅱ)的加入，蛋白質(zhì)部分肽段發(fā)生了聚合，硝化纖維蛋白原新增一條分子量約為110 kDa的電泳條帶，且隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大條帶越來(lái)越清晰。

2.4　討論

2.4.1Cu(Ⅱ)對(duì)硝化纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

纖維蛋白原的Aα鏈和Bβ鏈位于凝血酶的酶切位點(diǎn)，γ鏈只參與單體凝聚，與纖維蛋白原單體釋放無(wú)關(guān)。纖維蛋白原Aα鏈的α羧基端極性較強(qiáng)，是較易受損區(qū)域，有研究表明羥基自由基能夠誘導(dǎo)脂蛋白和纖維蛋白原單體間酪氨酸的交聯(lián)[8]，且纖維蛋白原中Aα的分子量為55 kDa，因此110 kDa的新增電泳條帶很可能是Aα鏈的酪氨酸發(fā)生了二聚。Cu(Ⅱ)的加入對(duì)硝化纖維蛋白原二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊產(chǎn)生了較大影響，導(dǎo)致α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度達(dá)1.66 mmol·L-1時(shí)，二者變化幅度分別為22.11％和24.71％。分子結(jié)構(gòu)中β-折疊比例的增加說(shuō)明Cu(Ⅱ)的加入促進(jìn)了纖維蛋白原分子內(nèi)部折疊骨架的展開(kāi)，使蛋白質(zhì)變得更加松散，從而使折疊于蛋白質(zhì)內(nèi)部的芳香族氨基酸殘基暴露，最終加劇了纖維蛋白原的硝化失活。

2.4.2Cu(Ⅱ)對(duì)硝化纖維蛋白原凝聚活性的影響

纖維蛋白原的硝化損傷程度與凝聚時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。凝聚實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)的添加對(duì)纖維蛋白原的硝化損傷表現(xiàn)了促進(jìn)作用，且凝聚活性的降低與Cu(Ⅱ)濃度呈負(fù)相關(guān)。Cu(Ⅱ)可以在堿性條件下與ONOO-反應(yīng)生成Cu(Ⅲ)和·NO2[16]，因此，在Cu(Ⅱ)存在下，ONOO-可能分解產(chǎn)生多種中間體損傷纖維蛋白原，但該過(guò)程較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

Cu(Ⅱ)的存在影響了硝化過(guò)程中纖維蛋白原分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致α-螺旋的減少和β-折疊的增加，α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變促進(jìn)了纖維蛋白原分子骨架的展開(kāi)，從而加劇了ONOO-對(duì)纖維蛋白原的硝化損傷。同時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化影響了纖維蛋白原的凝聚活性，但只是抑制了凝聚過(guò)程中單體的凝聚，并未影響纖維蛋白單體的釋放。該結(jié)果對(duì)于了解Cu(Ⅱ)在纖維蛋白原硝化過(guò)程中的作用、揭示ONOO-的損傷機(jī)理以及有關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]DUGA S,ASSELTA R,SANTAGOSTINO E,et al.Missense mutations in the humanβfibrinogen gene cause congenital a fibrinogenemia by impairing fibrinogen secretion[J].Blood,2000,95(4):1336-1341.

[2]黃其龍,林斌.纖維蛋白原對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2012,11(1):88-90.

[3]李華.血漿纖維蛋白原與急性冠脈綜合癥的相關(guān)性研究[J].醫(yī)學(xué)信息(西安上半月),2006,19(5):867-868.

[4]楊波,管昌益.纖維蛋白原與頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2013,11(5):71-73.

[5]LIPINSKI B.Pathophysiology of oxidative stress in diabetes mellitus[J].Journal of Diabetes and its Complications,2001,15(4):203-210.

[6]SHACTER E,WILLIAMS J A,LEVINE R L.Oxidative modification of fibrinogen inhibits thrombin-catalyzed clot formation[J].Free Radical Biology & Medicin,1995,18(4):15-21.

[7]STIEF T W,KURZ J,DOSS M O,et al.Singlet oxygen inactivates fibrinogen,factor Ⅴ,factor Ⅷ,factor Ⅹ,and platelet aggregation of human blood[J].Thrombosis Research,2000,97(6):473-480.

[8]TAKAHASHI I,INAGAKI N,NAKADA H,et al.Superoxide anion production by neutrophils in myelodysplastic syndromes (preleukemia)[J].Acta Medica Okayama,1988,42(1):15-19.

[9]LANCASTER J R.Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1994,91(17):8137-8141.

[10]PELUFFO G,RADI R.Biochemistry of protein tyrosine nitration in cardiovascular pathology[J].Cardiovascular Research,2007,75(2):291-302.

[11]DING Y,LUO Y J,FU J.Effects of Mn(Ⅱ) on peroxynitrite nitrifying fibrinogen[J].Bio-Medical Materials and Engineering,2014,24(1):901-907.

[12]丁楊,羅云敬,史建龍,等.鈷(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷及活性的影響研究[J].化學(xué)與生物工程,2013,30(3):17-20.

[13]UPPU R M,PRYOR W A.Synthesis of peroxynitrite in a two-phase system using isoamyl nitrite and hydrogen peroxide[J].Analytical Biochemistry,1996,236(22):242-249.

[14]REVERDIAU-MOALIC P,DELAHOUSSE B,BODY G,et al.Evolution of blood coagulation activators and inhibitors in the healthy human fetus[J].Blood,1996,88(3):900-906.

[15]AZPIAZU I,CHAPMAN D.Spectroscopic studies of fibrinogen and its plasmin-derived fragments[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,1992,1119(3):268-274.

[16]KOHNEN S,HALUSIAK E,MOUITHYS-MICKALAD A,et al.Catalytic activation of copper(Ⅱ) salts on the reaction of peroxynitrite with propofol in alkaline medium[J].Nitric Oxide,2005,12(4):252-260.