毛玉龍 張偉偉 左金華

1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.口腔正畸科，濱州 256603

放射治療、舍格倫綜合征以及涎腺炎導致的涎腺萎縮是臨床上常見且亟待解決的難題。研究涎腺對萎縮和再生的反應有可能為涎腺的放射防護設計或為涎腺萎縮的治療找到有效的途徑[1]。有學者[2]認為，肌上皮細胞（myoepithelial cell，MEC）可能是導致唾液腺多種疾病的潛能祖細胞之一；在繼發(fā)性舍格倫綜合征患者唾液腺炎癥病變過程中，MEC亦可作為靶細胞被淋巴細胞浸潤破壞，并最終導致腺泡和導管上皮喪失[3]。目前關于MEC在腮腺萎縮后再生過程中變化方面的研究較少，本實驗通過結扎大鼠腮腺主導管14 d后使其再通，建立腮腺萎縮后再生的動物模型，觀察MEC在該過程中的數量及分布的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

選用無特定病原體動物（specif ied pathogen free，SPF）級成年雄性Wistar大鼠54只為研究對象，質量（260±15）g，購于山東大學實驗動物中心（批號：魯動質字D20021024）。將大鼠隨機分為8個實驗組和1個正常對照組，每組6只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

將實驗組的大鼠使用質量分數為3%水合氯醛（10 mL·kg-1）行腹腔內注射麻醉，于右耳前下方切開皮膚，顯露右側腮腺主導管，用3—0絲線將直徑0.8 mm醫(yī)用鋼絲與主導管捆綁雙重結扎。主導管結扎后第14天，再次麻醉大鼠，取出醫(yī)用鋼絲使主導管再通，分別于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21天各處死1組大鼠，切取右側腮腺，放入質量分數4%的多聚甲醛固定液中固定。正常對照組僅手術顯露主導管但不結扎。

1.3 觀察方法

1.3.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察 將各組腮腺組織樣本固定24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片，進行HE染色，置于光學顯微鏡下觀察腮腺的組織學變化。

1.3.2 免疫組織化學染色觀察 采用特異性肌動蛋白α-SMA單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），應用SABC法對腮腺標本進行免疫組織化學染色，抗體稀釋度為1∶200，DAB顯色，蘇木精輕度復染，觀察MEC的陽性表達情況。

1.3.3 MEC計數 將免疫組織化學切片置于OLYMPUS BX51型顯微鏡下（Olympus公司，日本）觀察，每張切片隨機選擇5個視野拍照，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計數MEC的數目。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗所得數據采用SPSS 16.0軟件包進行方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 HE觀察結果

實驗動物的HE觀察結果見圖1。正常對照組：腮腺腺小葉中有密集的腺泡細胞及散在的導管系統(tǒng)（閏管、紋管及排泄管），腺泡細胞大小均勻，排列緊湊（圖1A）。實驗組：導管結扎14 d組（即再通0 d組），腮腺實質內絕大多數腺泡萎縮消失，僅在腺小葉邊緣可見少數散在且體積明顯減小的腺泡細胞，導管樣結構明顯增多，占據腺小葉的大部，并伴有大量炎癥細胞浸潤（圖1B）；再通1 d組與再通0 d組相比，腺小葉結構未見明顯變化；再通3 d組可見體積較小的新生腺泡出現在腺小葉邊緣（圖1C）；再通5 d組可見除腺小葉邊緣外，腺小葉中央新生腺泡數量也明顯增多，導管樣結構明顯減少；再通7 d組，成熟的腺泡細胞已占據大部分腺小葉，腺泡形態(tài)基本恢復正常，但腺泡排列仍較正常對照組稀疏（圖1D）；再通10 d組，成熟腺泡進一步增多，導管系統(tǒng)進一步減少；再通14 d組及再通21 d組，腺小葉的結構與正常對照組相近，沒有發(fā)現明顯差異。

圖1 正常對照組及實驗組腮腺的組織學變化 HE× 400Fig 1 Histological changes of parotid glands for control and experimental group HE× 400

2.2 免疫組織化學觀察結果

正常對照組：呈陽性表達的MEC主要分布在閏管及腺泡周圍，形態(tài)呈星形或梭形，紋管周圍亦可見少量MEC（圖2A）；再通0 d組與正常對照組比較，MEC數目明顯增多，主要分布在大量導管樣結構周圍，此時導管樣結構呈典型的雙套層結構，大量MEC位于外層，形態(tài)呈梭形或星形（圖2B）；再通1 d組與再通0 d組對比，MEC數目及分布未見明顯改變；再通3 d組，隨著新生腺泡的出現，MEC數目明顯減少，大多分布在導管樣結構及新生腺泡周圍（圖2C）；再通5 d組，新生腺泡逐漸增多，導管樣結構明顯減少，MEC數目進一步明顯減少；再通7 d組，新生腺泡已占據大部分腺小葉，導管樣結構明顯減少，MEC數目減少變緩，主要分布在體積較小的新生腺泡及導管系統(tǒng)表面（圖2D）；再通10 d組，MEC數量進一步減少；再通14 d組及21 d組，腺小葉結構基本恢復正常，MEC數目及分布也基本恢復正常，與正常對照組未見明顯差別。

圖2 正常對照組及實驗組腮腺MEC的陽性表達 SABC× 400Fig 2 MEC positive expression in parotid glands for control and experimental group SABC× 400

2.3 MEC計數結果

各組動物的MEC計數結果見表1：與正常對照組相比，再通0、1、3、5、7、10 d組的MEC數量均有明顯差異（P<0.05），再通14 d及21 d組無明顯差異（P>0.05）；再通3、5 d時MEC數量下降最為明顯，再通7 d開始，MEC數量下降明顯放緩。

表1 腮腺再生過程中不同時間點的MEC計數Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

表1 腮腺再生過程中不同時間點的MEC計數Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

注：*與正常對照組相比，P<0.05。

組別MEC數量正常對照550.40±80.465再通0 d1 584.30±180.426*再通1 d1 504.62±205.847*再通3 d1 242.55±272.810*再通5 d891.25±312.467*再通7 d765.50±245.214*再通10 d688.64±166.376*再通14 d611.26±154.379再通21 d584.50±138.589

3 討論

本實驗按照潘光華等[4]的實驗方法，將醫(yī)用鋼絲捆綁結扎于大鼠腮腺主導管，14 d后取出鋼絲使導管再通，成功制造了腮腺萎縮后再生的動物模型。本實驗觀察到，主導管結扎后14 d，腺泡細胞幾乎全部消失，取而代之的是腺體內出現了大量的導管樣結構，腺實質大量炎癥細胞浸潤，僅在腺小葉邊緣殘留少量的腺泡細胞。通過免疫組織化學染色方法，觀察到MEC的數量明顯增多，幾乎全部分布于導管樣結構的周圍，呈雙套層樣結構，形態(tài)呈梭形或星形。這與趙騰達等[5]的觀察結果是一致的。

主導管結扎后腺體萎縮的機理目前仍然不明確。大部分學者[6-7]認為，這是由于細胞自身的凋亡造成的；但Fujita-Yoshigaki等[8]發(fā)現，涎腺萎縮過程中，腺泡細胞可通過Src-p38MAPs信號傳導通路快速轉變?yōu)閷Ч軜蛹毎?。還有學者[9]通過分子生物學研究發(fā)現，在涎腺萎縮過程中，導管細胞因過表達抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病（B-cell lymphoma/leukemia，Bcl）基因未發(fā)生凋亡，而腺泡細胞由于表達Bcl相關X蛋白Bax而促進其自身的凋亡。

Burgess等[10]指出，在腺體萎縮過程中，MEC能在一定程度上抑制腺體的萎縮。MEC內含有肌動蛋白，能夠發(fā)生收縮，促進腺泡及導管的分泌[11]。大量研究發(fā)現，MEC在正常狀況下增殖率很低，當腺體受到損傷時則出現快速增殖。Walker等[12]發(fā)現，在正常唾液腺內很少觀察到MEC，但隨著腺體進行性萎縮，MEC陽性表達明顯，并最終完全圍繞在導管樣結構周圍。本研究中，主導管結扎14 d后，腺泡細胞大量消失，而MEC數量不減反增，說明MEC在抑制腺體萎縮方面發(fā)揮了重要作用。筆者推測出現這種現象的原因在于，當導管發(fā)生阻塞時，導管內的壓力增加，腺泡細胞不再需要MEC促進分泌，為了抵抗導管阻塞帶來的壓力，MEC大量增殖，并圍繞在導管周圍；同時由于腺體萎縮，單位視野中MEC數量相對增多。關于大量增生的MEC的來源，目前存在兩種觀點：一是導管細胞作為潛能細胞大量分化為MEC，二是原來位于腺泡周圍的MEC發(fā)生了移行。至于具體原因還需要進一步研究。

本實驗觀察到，主導管再通第1天至第5天時，導管樣結構明顯減少，體積較小的新生腺泡細胞自腺小葉邊緣開始大量增殖；究其來源，大部分學者[13]認為是由閏管儲備細胞分化而來，筆者認為，腺小葉周圍殘余的腺泡細胞主動增殖分化也是其大量增殖的原因之一。此階段MEC數量減少最為明顯，且主要分布在新生腺泡周圍，故筆者推測，腮腺的再生主要發(fā)生在主導管再通后的5 d內。再通第7天，隨著腺體的再生恢復，MEC數量減少的程度不如前期明顯，形態(tài)也逐漸恢復正常，主要分布在體積較小的新生腺泡及殘存的導管樣組織周圍。再通14 d時，鏡下觀察到的腺實質內各解剖結構及MEC已基本恢復正常。

綜上所述，本研究通過建立腮腺萎縮后再通的動物模型，成功觀察到腮腺萎縮后再生過程中MEC及腺小葉中各結構的組織學變化，為研究腮腺導管阻塞后再通的變化提供理論依據，并為進一步研究腮腺萎縮的治療打下基礎。

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