凌彬 陳曼麗 劉潔 尹小朋 林兆全 龔忠誠(chéng)

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科；2.新疆醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830000

嬰幼兒血管瘤（infantile hemangioma）是胚胎期血管形成過(guò)程中出現(xiàn)的一種先天性發(fā)育不良，多見(jiàn)于出生時(shí)或出生后不久，是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的良性腫瘤[1]，發(fā)病率為5%～10%，在早產(chǎn)兒中可高達(dá)30%[2]。Léauté-Labrèze等[3]于2008年首次報(bào)道了使用普萘洛爾治療多例嬰幼兒血管瘤取得了顯著的療效，然而其治療機(jī)制至今尚不完全明確。

表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域（epidermal growth factorlike domain，EGFL）7由Soncin在2003年發(fā)現(xiàn)，是定位于人類(lèi)9號(hào)染色體上的一個(gè)內(nèi)皮特異性基因，在胚胎發(fā)育過(guò)程的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)[4]。EGFL7是血管管腔發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，其表達(dá)降低可直接引起血管管腔的發(fā)育障礙[5]。增殖期血管瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）及其他促血管生成因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖，EGFL7通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷徙，維持了血管正常的空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的EGFL7阻止平滑肌細(xì)胞的遷出，保證了腫瘤血管的穩(wěn)定性，在其共同作用下，血管瘤得以快速增殖。本研究旨在對(duì)臨床應(yīng)用普萘洛爾治療嬰幼兒增殖期血管瘤患者VEGF-A、EGFL7的變化進(jìn)行檢測(cè)，探討其可能的治療機(jī)制及對(duì)治療的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

以2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《口腔頜面部血管瘤及脈管畸形的診斷和治療指南（草案）》[6]作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集2010年8月—2013年2月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科收治的30例嬰幼兒增殖期血管瘤患者為研究對(duì)象。30例患者中，男性10例，女性20例；年齡2～11個(gè)月，平均8個(gè)月；漢族17例，維吾爾族8例，回族3例，蒙古族2例；頜面部27例，軀干2例，四肢1例。研究中納入的嬰幼兒血管瘤瘤體直徑至少大于1 cm。參與研究的患者在采集血樣本之前均未接受過(guò)任何治療。

本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在治療與實(shí)驗(yàn)前所有患者的監(jiān)護(hù)人均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法

患兒入院后完善血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能、心電圖、血壓、血糖檢查。對(duì)于各項(xiàng)檢查符合要求的患兒口服普萘洛爾（天津力生制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)H12020151）?？诜幬锏闹委煼桨富谇捌谂R床研究[7]進(jìn)行了優(yōu)化：小于3個(gè)月的患者口服劑量為每天0.5 mg·kg-1；3～6個(gè)月大小的患者口服劑量為每天1 mg·kg-1；大于6個(gè)月的患者口服劑量為每天2 mg·kg-1。每次服藥前、服藥后0.5、1、2、3 h監(jiān)測(cè)心率、血壓。

當(dāng)患者出現(xiàn)以下情況時(shí)不能服藥：急性炎癥（如急性上呼吸道感染、氣管炎、肺炎等）、血小板功能異常、哮喘、竇性心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)阻滯、嚴(yán)重或急性充血性心力衰竭、心源性休克或肝、腎功能異常等疾病；血糖、甲狀腺功能有異常者；接受手術(shù)和激光治療者；年齡大于12月者；藥物過(guò)敏史合并其他先天性疾病者；資料不完整者、不配合治療者和不簽署知情同意書(shū)者。

藥物在需進(jìn)食時(shí)服用。開(kāi)始口服普萘洛爾后所有患兒入院觀察3～5 d?；純撼鲈汉螅诟改富虮O(jiān)護(hù)人指導(dǎo)下給予口服普萘洛爾。療程持續(xù)4～8個(gè)月，如果患兒血管瘤完全消退或整個(gè)療程達(dá)到8個(gè)月則停止服用藥物。

所有患兒在出院后定期隨訪。隨訪時(shí)患兒給藥劑量根據(jù)患兒體重的變化進(jìn)行調(diào)整。

1.3 臨床療效評(píng)價(jià)

治療前和治療后12周通過(guò)B超測(cè)量瘤體的層次、大小、血運(yùn)、邊界。根據(jù)B超得出的瘤體大小，采用國(guó)際上公認(rèn)的Achauer療效評(píng)定法[8]進(jìn)行臨床療效評(píng)估。Ⅰ級(jí)（差）：瘤體縮小<25%；Ⅱ級(jí)（中等）：瘤體縮小 26%～50%；Ⅲ級(jí)（好）：瘤體縮小 51%～75%；Ⅳ級(jí)（優(yōu)）：瘤體縮小>75%。

1.4 治療前后血清及尿液中VEGF-A和EGFL7表達(dá)的測(cè)定

分別抽取每例患者服用普萘洛爾前、服藥后4周和12周外周靜脈血2 mL、尿液5 mL。血液樣本放置于無(wú)菌離心管中室溫下靜置60 min，采用轉(zhuǎn)速為2 000 g·min-1離心機(jī)離心10 min分離血清。離心后的血清樣本凍存于?80 ℃，避免反復(fù)凍存和融化。采用相同方法處理尿液標(biāo)本。所有樣本在室溫下解凍，VEGF-A試劑盒由eBioscience公司提供，EGFL7試劑盒由CUSABIO（CSB-E15864h）公司提供。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定血清和尿液中VEGF-A、EGFL7的含量，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用兩因素方差分析（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），兩兩比較采用LSD法比較。治療效果采用Ridit方法分析，將有序等級(jí)資料轉(zhuǎn)化成連續(xù)型資料（R值），轉(zhuǎn)化后采用單因素方差分析F檢驗(yàn)。在F值有意義的情況下，再進(jìn)行多組間兩兩比較的LSD檢驗(yàn)。對(duì)VEGF-A與EGFL7，VEGF-A、EGFL7與給藥時(shí)程的關(guān)系進(jìn)行BIVARIATE相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

整個(gè)治療過(guò)程中均未出現(xiàn)明顯副作用，無(wú)1例患者退出治療。首次治療24 h后多數(shù)血管瘤瘤體顏色變淺并且質(zhì)地變軟，其中1例患者服用普萘洛爾3個(gè)月后瘤體完全消退。

治療效果評(píng)價(jià)： 2例（17%）優(yōu)，11例（46%）好，14例（29%）中等，3例（9%）差。總有效率為90%（27/30）。

不同性別、民族、部位的血管瘤患者間的治療效果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。治療后4周與治療后12周的治療效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），治療后12周治療效果優(yōu)于治療后4周，說(shuō)明隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，治療效果越來(lái)越顯著。治療后4周不同血管瘤分型（淺表型、混合型、深部型）的治療效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；治療后12周不同血管瘤分型（淺表型、混合型、深部型）的治療效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）（圖1），隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，深部或混合型血管瘤的治療效果優(yōu)于淺表型血管瘤。

2.2 治療前后血清及尿液中VEGF-A的表達(dá)

治療前后血清及尿液中VEGF-A的表達(dá)見(jiàn)表1。治療前血清VEGF-A水平最高（335.692 pg·mL-1±136.146 pg·mL-1），治療后4周（264.853 pg·mL-1±122.120 pg·mL-1）和治療后12周（211.345 pg·mL-1±104.035 pg·mL-1）呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，治療后4、12周的血清VEGF-A水平低于治療前（P<0.05）。治療前尿液VEGF-A水平最高（76.234 pg·mL-1±24.169 pg·mL-1），治療后4周（56.454 pg·mL-1±16.111 pg·mL-1）和治療后12周（34.728 pg·mL-1±12.656 pg·mL-1）呈逐漸下降趨勢(shì)，治療后4、12周，尿中液VEGF的表達(dá)水平較治療前明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 不同治療時(shí)間、血管瘤分型的治療效果的Ridit分析Fig 1 Ridit analysis of therapeutic effect of different treatment time and type of hemangioma

表1 治療前后血清及尿液中VEGF-A和EGFL7的表達(dá)Tab 1 The expression of VEGF-A and EGFL7 in serum and urinary before and after treatment pg·mL-1

2.3 治療前后血清及尿液中EGFL7的表達(dá)

治療前后血清及尿液中EGFL7的表達(dá)見(jiàn)表1。治療前血清EGFL7水平最高，治療后4周和12周EGFL7水平呈逐漸下降趨勢(shì)，低于治療前（P<0.05）。治療前尿液EGFL7水平最高，治療后4周和12周EGFL7水平呈逐漸下降趨勢(shì)，低于治療前（P<0.05）。血清和尿液中EGFL7的表達(dá)趨勢(shì)與VEGF-A一致。VEGF-A和EGFL7水平兩兩比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.4 VEGF-A與EGFL7的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，血清VEGF-A與EGFL7不相關(guān)（r=-0.082，P>0.05），尿液VEGF-A與EGFL7呈正相關(guān)（r=0.657，P<0.05）。

2.5 VEGF-A、EGFL7與給藥時(shí)程的相關(guān)性分析。

血清及尿液中的VEGF-A、EGFL7含量與給藥時(shí)程均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，血清及尿液中的VEGF-A和EGFL7含量逐漸減少（P<0.05）（表2）。

表2 VEGF-A、EGFL7與給藥時(shí)程的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis between VEGF-A,EGFL7 and administration time

3 討論

本研究對(duì)治療效果分析發(fā)現(xiàn)，患者的性別、民族、治療部位與患者的治療效果無(wú)關(guān)；治療時(shí)間越長(zhǎng)，治療效果越好；血管瘤的分型與治療效果密切相關(guān)，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，深部型或混合型血管瘤的治療效果優(yōu)于淺表型血管瘤。特別值得注意的是，普萘洛爾對(duì)腮腺區(qū)較大的深部血管瘤具有明顯療效，此類(lèi)病變治療后明顯縮小，而相對(duì)于表淺的侵犯皮膚的血管瘤，其治療效果欠佳。治療過(guò)程中無(wú)1例患者退出治療。大多數(shù)血管瘤在首次治療后24 h瘤體顏色變淺并且質(zhì)地變軟。治療過(guò)程中均無(wú)明顯副作用?；颊呒议L(zhǎng)對(duì)治療效果滿(mǎn)意。其中1例患者服用普萘洛爾3個(gè)月后瘤體完全消退。然而，有些瘤體在患兒突然停藥后復(fù)發(fā)，通過(guò)繼續(xù)服用藥物治療能有效地控制增殖，因此停藥時(shí)需告知家長(zhǎng)緩慢停藥。

VEGF是最重要的一種血管生成調(diào)節(jié)因子，能有效地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中，VEGF可以特異性地作用于VEGF受體，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管的通透性，促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)。

EGFL7基因是由Soncin等[4]的實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在血管內(nèi)皮特異性表達(dá)的基因，EGFL7屬于分泌型蛋白，包含兩個(gè)生長(zhǎng)因子類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域。EGFL7存在于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，通過(guò)分泌至內(nèi)皮細(xì)胞附近，可能與細(xì)胞間基質(zhì)有關(guān)[9]。Parker等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，EGFL7涉及血管形成過(guò)程中成管這一關(guān)鍵性的步驟，在生理性和病理性血管的管腔形成、功能完善上發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)改變將影響血管的新生。另有研究[10]表明，在血管增生過(guò)程中，EGFL7通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和黏附，使內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)的結(jié)合及局部遷移受到協(xié)調(diào)控制，通過(guò)進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管生成組織或內(nèi)皮細(xì)胞的逐漸分離和恰當(dāng)?shù)目臻g排列，導(dǎo)致血管管腔形成。EGFL7在促進(jìn)血管內(nèi)皮遷徙、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及抑制血管平滑肌遷徙等構(gòu)建血管床結(jié)構(gòu)和保持血管穩(wěn)定中起著重要作用，但是EGFL7并不能刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[9-11]。

Campagnolo等[12]研究認(rèn)為，EGFL7可作為一個(gè)化學(xué)趨化性物質(zhì)刺激、增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力。化學(xué)趨化物介導(dǎo)細(xì)胞定向趨化運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，也可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。RAS/MAPK通路的激活等可增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力[13-14]，最終可導(dǎo)致血管內(nèi)皮遷移活躍，血管新生增加。

血管形成是一個(gè)復(fù)雜但有序的嚴(yán)格調(diào)節(jié)的過(guò)程，分子間發(fā)生了復(fù)雜的相互作用，涉及多種可溶性因子及其受體。血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的接觸也參與血管生成過(guò)程[15-16]；因此，形成一個(gè)局部穩(wěn)定和有功能的血管結(jié)構(gòu)，最終取決于這些復(fù)雜的相互反應(yīng)。EGFL7是血管管腔形成所必需的，高水平的EGFL7表達(dá)與血管增生和重塑有關(guān)[5]。EGFL7基因是血管管腔發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因，與VEGF在血管形成中的作用明顯不同，前者表達(dá)降低可以直接引起血管管腔的發(fā)育障礙，而后者則使內(nèi)皮細(xì)胞的增生性能明顯降低，間接地影響了血管的發(fā)育。

VEGF基因的轉(zhuǎn)錄受到多種細(xì)胞因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等的調(diào)節(jié)。這是因?yàn)閂EGF基因啟動(dòng)子序列中相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的50～96 bp區(qū)域?yàn)镚-C豐富區(qū)[17]，此啟動(dòng)子區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄因子SP-1/SP-3、早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1及AP-2結(jié)合位點(diǎn)。推測(cè)EGFL7亦可能通過(guò)與特定的轉(zhuǎn)錄子SP-1、SP-3或與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控VEGF基因表達(dá)。

蔣衛(wèi)東等[18]研究顯示，EGFL7亦可能與其他的血管生長(zhǎng)因子通過(guò)相同的信號(hào)通路相互影響，這與內(nèi)皮細(xì)胞的活性有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的EGFL7基因被有效沉默后，三磷酸腺苷和乳酸脫氫酶等的檢測(cè)結(jié)果均顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的存活率受到了一定程度的影響，EGFL7可能是一種內(nèi)皮細(xì)胞存活或活性維持的重要基因，一旦其基因沉默，內(nèi)皮細(xì)胞活性降低，VEGF等生長(zhǎng)因子表達(dá)水平降低。

本研究中也發(fā)現(xiàn)，在服用普萘洛爾治療4周及12周后，患者血清及尿液的VEGF及EGFL7表達(dá)量明顯減低，兩者呈同步下降的趨勢(shì)，符合正調(diào)控關(guān)系。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可以認(rèn)為普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤起效，其可能的機(jī)制是通過(guò)降低EGFL7的表達(dá)，使EGFL7對(duì)VEGF基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用減弱，導(dǎo)致VEGF轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，VEGF表達(dá)減少，從而使血管新生活力下降，通過(guò)間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞使得血管瘤瘤體變小。這些細(xì)胞因子之間可能還存在一些其他的通路或相關(guān)因子的調(diào)控作用，這尚需進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)明確普萘洛爾成功治療血管瘤的機(jī)制。

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