田 迎，王建東，滕兆剛，盧光明，鄭 玲

293T細(xì)胞對(duì)介孔二氧化硅納米材料的攝取研究

田 迎，王建東，滕兆剛，盧光明，鄭 玲

目的：研究在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下，293T細(xì)胞對(duì)介孔二氧化硅納米材料（mesoporous silica nanomaterials，MSNs）的攝取變化。方法：制備和表征MSNs；293T細(xì)胞分別與100 μg/mL MSNs、MSNs+Lipofectamine 2000共孵育，通過(guò)透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察及定量分析293T細(xì)胞對(duì)材料的攝取。結(jié)果：TEM、X線衍射及氮?dú)馕?脫附分析表明，制備的MSNs結(jié)構(gòu)規(guī)則、分散性好，尺寸在100 nm左右；TEM定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lipofectamine 2000顯著提高了293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取，P＜0.001。結(jié)論：Lipofectamine 2000能提高293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取，為MSNs在293T細(xì)胞內(nèi)的生物應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

介孔二氧化硅納米材料；Lipofectamine 2000；細(xì)胞攝取

0 引言

介孔二氧化硅納米材料（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）具有載藥、靶向成像、診療等潛在的應(yīng)用價(jià)值，成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)[1-3]。細(xì)胞攝取對(duì)MSNs生物功能的發(fā)揮有重要的影響，MSNs表面的電荷修飾也反過(guò)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)材料的吞噬[4]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000是用于DNA、RNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的生物學(xué)常規(guī)試劑，其作用原理是帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合帶負(fù)電的核酸物質(zhì)，形成核酸-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，進(jìn)一步吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，通過(guò)內(nèi)吞作用導(dǎo)入細(xì)胞[5]。目前，利用Lipofectamine 2000這一性質(zhì)，包被或中和MSNs表面的負(fù)性電荷來(lái)提高M(jìn)SNs細(xì)胞攝取率的研究還鮮有報(bào)道。本文針對(duì)此研究目的，初步探索在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下人胚腎細(xì)胞系293T對(duì)MSNs攝取的影響。

1 主要材料與方法

1.1 MSNs的制備和表征

MSNs由實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法參照文獻(xiàn)[6]。MSNs利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）進(jìn)行表征，加速電壓為200 kV。首先配制0.05 g/L納米粒的乙醇溶液，超聲分散均勻后，滴于覆蓋有膜的銅網(wǎng)上，真空干燥后，于Hitachi H-8100型透射電子顯微鏡下拍攝，觀察納米粒的尺寸及分散性。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞系293T購(gòu)自ATCC（Americantypecul ture collection）細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO）中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48 h傳代1次。

1.3 MSNs與293T共孵育

將0.5 mg MSNs溶解在0.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Op-ti-MEM I（Invitrogen）中，使終濃度（質(zhì)量濃度）為100 μg/mL。將20 μL Lipofectamine 2000（Invitrogen）溶解在0.5 mL Op-ti-MEM I中，輕輕混勻。5 min

后，MSNs和Lipo-fectamine 2000充分混勻，室溫孵育20 min。將混合物加入到匯合度70%、60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的293T細(xì)胞中，在37℃下孵育24 h，無(wú)Lipofectamine 2000介導(dǎo)的MSNs與293T孵育作為對(duì)照。

1.4 透射電鏡觀察293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取

待293T細(xì)胞匯合度達(dá)70%后，加入混合均勻的MSNs，使其終濃度為100 μg/mL，于37℃下孵育24 h，清洗消化，收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定1 h，丙酮脫水，Epon-812樹(shù)脂包埋，45～65℃聚合48 h，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1011型透射電鏡觀察細(xì)胞對(duì)材料的吞噬結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，定量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。2組均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSNs的合成和表征

MSNs制備后裝入小型化學(xué)玻璃容器中，靜置一段時(shí)間后觀察納米顆粒成乳白色且均勻地分散在溶液中，如圖1（a）所示。TEM顯示MSNs呈規(guī)則球狀，尺寸在100 nm左右，顆粒之間無(wú)連接，如圖1（b）所示。MSNs的X線衍射圖上有3個(gè)衍射峰（100、110、200），表明此顆粒具有高度有序、規(guī)則的二維六方結(jié)構(gòu)，如圖1（c）所示。氮?dú)馕?脫附等溫曲線顯示在相對(duì)壓力0.1～0.3處出現(xiàn)了快速的毛細(xì)凝聚，說(shuō)明MSNs具有均一的介孔結(jié)構(gòu)。計(jì)算得到MSNs的比表面積和孔容分別為834 m2/g和0.49 cm3/g。窄的孔徑分布曲線進(jìn)一步證明MSNs具有均一的介孔孔徑，經(jīng)過(guò)吸附分支計(jì)算得到的孔徑尺寸為2.3 nm，如圖1（d）所示。

2.2 293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取

TEM進(jìn)一步觀察在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下人胚腎細(xì)胞系293T對(duì)MSNs攝取的影響，無(wú)脂質(zhì)體介導(dǎo)下的細(xì)胞攝取作為對(duì)照，MSNs終濃度為100 μg/mL，如圖2所示。293T細(xì)胞非特異性吞噬MSNs，首先形成內(nèi)涵體，之后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)形成二級(jí)溶酶體。通過(guò)定量包被MSNs的二級(jí)溶酶體后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組293T細(xì)胞的平均攝取率為18%對(duì)比，在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，293T細(xì)胞對(duì)MSNs的平均攝取率為85%，P＜0.001，攝取率顯著提高，如圖3所示。

3 討論

（a）MSNs分散性

（b）TEM分析

圖1 MSNs性質(zhì)分析

圖2 TEM觀察在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取

圖3 TEM觀察下定量分析293T細(xì)胞對(duì)MSNs的攝取變化

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，MSNs以其規(guī)則的孔徑結(jié)構(gòu)、

可調(diào)的尺寸電荷、較大的表面積及可載藥的孔徑結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，成為應(yīng)用于多模態(tài)成像、靶向治療研究的新型多功能材料[7]。增加細(xì)胞對(duì)納米材料的攝取可以提高M(jìn)SNs潛在的生物醫(yī)藥功能，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，為臨床疾病的特異性成像和靶向治療提供基礎(chǔ)[8]。細(xì)胞膜攜帶負(fù)電荷，使得同樣表面帶負(fù)電荷的MSNs的細(xì)胞吞噬率降低。脂質(zhì)體是一種具有親水頭部和疏水尾部的雙層脂分子的人工膜，利用其能和細(xì)胞膜融合的特點(diǎn)，可將藥物或基因送入細(xì)胞內(nèi)部，是應(yīng)用較多的生物學(xué)常規(guī)試劑。Zhang Z等[9]發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000能夠促使超順磁性氧化鐵顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）進(jìn)入細(xì)胞，且脂質(zhì)體本身的細(xì)胞毒性很小。因此，本實(shí)驗(yàn)利用Lipofectamine 2000的特性，將納米材料包裹在其陽(yáng)性電荷表面并與細(xì)胞膜融合，研究在 Lipofectamine 2000介導(dǎo)下人胚腎細(xì)胞系293T非特異性攝取MSNs的變化。

本文制備的MSNs具有均一、有序的球狀結(jié)構(gòu)，其表面攜帶負(fù)電荷，未交聯(lián)特異性配體，分散性較好。TEM結(jié)果顯示，MSNs進(jìn)入細(xì)胞后仍有良好的分散性，狀態(tài)良好。定量包被MSNs的二級(jí)溶酶體發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，細(xì)胞攝取率明顯高于對(duì)照組，P＜0.001。陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000能有效提高 MSNs的細(xì)胞攝取率，是一種安全有效的脂類(lèi)材料。繼續(xù)深入利用和開(kāi)發(fā)脂質(zhì)體的細(xì)胞相容性作用，提高納米材料在細(xì)胞中的攝取和生物功能的研究，實(shí)現(xiàn)生物材料與化學(xué)材料的有機(jī)結(jié)合，對(duì)推動(dòng)納米材料向生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

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（收稿：2013-07-31 修回：2013-12-10）

Experimental Study of Mesoporous Silica Nanomaterials Uptake in 293T Cell

TIAN Ying1,WANG Jian-dong2,TENG Zhao-gang1,LU Guang-ming1,ZHENG Ling1
(1.Department of Medical Imaging,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China;、2.Department of Pathology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China)

Objective To study Lipofectamine 2000-guided uptake ofmesoporous silica nanomaterials(MSNs)in 293T cells.Methods MSNswere synthesized and characterized;293T cellswere incubated with MSNsorMSNsand Lipofectamine 2000 re-spectively,which both had a concentration of100μg/mL.Transmission electronmicroscope(TEM)wasused to analyze the up-take of MSNs in 293T cells.Results The analyses by TEM,X-ray diffraction and Nitrogen absorption-desorption showed theprepared MSNs behaved well in structure and dispersion and had a size of100 nm.TEM quantitative analysis found that Lipo-fectamine 2000 significantly enhanced the uptake ofMSNs in 293T cells,with P 0.01.Conclusion MSNs uptake promoted byLipofectamine 2000 lays a foundation for its biological application in 293T cells.[Chinese Medical Equipment Journal，2014，35（3）：26-28]

Mesoporous silica nanomaterials;Lipofectamine 2000;cellular uptake

R318

A

1003-8868（2014）03-0026-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2014.03.026

田 迎（1983—），女，碩士，技師，主要從事分子影像與分子病理學(xué)方面的研究工作，E-mail：ty52111@sina.com。

210002南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（田 迎，滕兆剛，盧光明，鄭 玲），醫(yī)學(xué)病理科（王建東）

鄭 玲，E-mail：cjr.zhengling@vip.163.com