楊非柯 劉竟芳 陳偉 何新平 盧桂靜

.基礎研究.

外源性硫化氫對胰島素抵抗脂肪細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體4表達的影響

楊非柯 劉竟芳 陳偉 何新平 盧桂靜

目的 觀察外源性硫化氫(H2S)對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗(IR)的影響，并探討其機制。方法 用高糖高胰島素培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞，建立IR細胞模型，外源性H2S供體NaHS (10-5、10-4和10-3mol/L)處理IR 3T3-L1細胞12、24和48 h。MTT法檢測細胞活力，葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量，2-脫氧-［3H］-D-葡萄糖攝入法檢測葡萄糖的攝取。實時定量PCR和Western blot檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(Glut4)的表達。結(jié)果 與對照組比較，IR模型組細胞葡萄糖消耗和攝取量以及Glut4 mRNA和蛋白的表達顯著降低(均為P＜0.05)。與對照組比較，所有濃度的NaHS均未影響細胞活力。與IR模型組比較，NaHS(10-4和10-3mol/L)處理24和48 h顯著增加細胞葡萄糖消耗和攝取量以及Glut4 mRNA和蛋白的表達(均P＜0.05)。結(jié)論 外源性H2S改善了高糖高胰島素誘導的脂肪細胞的IR，其機制可能與H2S上調(diào)Glut4的表達有關(guān)。

硫化氫； 胰島素抵抗； 高糖； 高胰島素； 葡萄糖轉(zhuǎn)運體4型

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被稱為第三種氣體信號分子，廣泛分布于心血管、內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)等［1-2］。研究顯示，H2S在胰島素抵抗(insulin resistance，IR)發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［3］。本研究應用硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)作為H2S供體，觀察外源性H2S對3T3-L1脂肪細胞IR的影響，并探討其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-L1前脂肪細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞庫。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、NaHS、重組人胰島素和四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Sigma公司。高糖和低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV)試劑盒、Trizol、Hot Star Taq Master Mix試劑盒購自Invitrogen公司。羊抗小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter 4，Glut4)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗購自Santa Cruz公司。增強化學發(fā)光法試劑盒購自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪細胞的培養(yǎng)、誘導分化和分組 用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞。狀態(tài)良好的細胞接種于培養(yǎng)板，待細胞生長融合2 d后加入含胰島素(1 mg/L)、地塞米松(1.0 μmol/L)、IBMX(0.5 mmol/L)和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，換液后，再用含胰島素(1 mg/L)和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。換液后，以10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，誘導分化8～10 d后，90%～95%的3T3-L1細胞呈現(xiàn)脂肪細胞表型，用于后續(xù)實驗。實驗分為對照組、IR模型組、NaHS(10-5、10-4和10-3mol/L)處理IR 3T3-L1細胞12、24和48 h組。

1.2.2 IR脂肪細胞模型建立 含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞48 h。更換培養(yǎng)液，用無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。更換培養(yǎng)液，用含10-7mol/L胰島素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，建立IR脂肪細胞模型。

1.2.3 細胞活力的檢測 細胞用胰酶消化后，制成細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為5×104個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔均200 μl培養(yǎng)液。37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各實驗組處理結(jié)束后，每孔加入MTT溶液20 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，更換培養(yǎng)液，加入200 μl DMSO，充分振蕩使晶體溶解。用酶標儀測定波長為490 nm的每孔吸光度值(A值)。

1.2.4 葡萄糖消耗量的檢測 將96孔板中誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞以含0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。各實驗組處理結(jié)束后，更換培養(yǎng)液，用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，空白對照組(未接種細胞)糖含量的均值作為基礎值，計算各實驗組細胞的葡萄糖消耗量。

1.2.5 葡萄糖攝取的檢測 各實驗組處理結(jié)束后，在24孔板中每孔加入含或不含10-7mol/L胰島素的KRP緩沖液，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)30 min。然后加入l ml含0.5 μCi/ml 2-脫氧-［3H］-D-葡萄糖的KRP緩沖液，在37℃下繼續(xù)孵育10 min。用預冷的含葡萄糖(10 mmol/L)的PBS快速清洗3次，終止反應，然后加入1 m l NaOH(0.1mol/L)孵育2 h使細胞充分裂解。取適量的細胞裂解液，在液閃計數(shù)儀上測定閃爍值。以10 μmol/L的細胞松弛素B作為對照，同樣的方法計算出細胞對2-脫氧-［3H］-D-葡萄糖的非特異性攝取率，所有數(shù)據(jù)均減去此值，作為各實驗組細胞的葡萄糖攝取率。

1.2.6 實時定量PCR檢測Glut4 mRNA的表達各實驗組處理結(jié)束后，收集細胞。用Trizol法提取細胞總RNA。以不同處理實驗組的細胞總RNA為模板，Oligo(dT)15為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。將cDNA樣品進行梯度稀釋，取適量的cDNA樣品分別進行實時定量PCR反應。反應總體系為30 μl:cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex TaqTM8 μl，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μl，dNTP Mix(2×) 8 μl，用無菌去離子水補足30 μl。PCR反應條件為:95℃10 s，94℃10 s，60℃60 s，共40個循環(huán)。每次擴增均以無菌去離子水替模板作為空白對照。Glut4引物序列為:上游:5'-GGCTGTGAGTGAGTGCTIT-3'，下游:5'-GGTITCTGCTCCCTATCGT-3'。以β-actin作為內(nèi)參，β-actin引物序列為:上游:5'-GCATCTTCATGCACCAGCT-3'，下游:5'-GAGGCTGTAAGCAATGCTTG-3'。采用2-ΔΔCT法處理實時定量PCR數(shù)據(jù)，以對照組為100%對Glut4 mRNA的表達進行定量分析。

1.2.7 Western blot檢測Glut4的表達 收集各實驗組細胞，用冷的PBS清洗滌3次。加入RIPA蛋白裂解液1 m l，吹打數(shù)次，裂解細胞30 min后，4℃，15 000 g/min離心10 min，取上清，提取細胞的總蛋白。BAC法測定上清蛋白質(zhì)濃度。取100 μl蛋白質(zhì)樣本經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果并確定蛋白標準位置。用含10%脫脂奶粉的TBST溶液室溫下封閉2 h。TBST緩沖液洗膜3次，加入羊抗小鼠Glut4 (1∶200)和β-actin(1∶400)一抗，4℃下過夜。洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，4℃下孵育4 h。洗膜3次，加入ECL試劑盒，X線片曝光。顯影和定影后，掃描儀掃描電泳條帶，凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行光密度積分值分析，以Glut4與內(nèi)參β-actin的光密度積分值之比作為Glut4的相對蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1脂肪細胞IR模型的鑒定

與對照組比較，高糖高胰島素組細胞的葡萄糖消耗量顯著降低，葡萄糖轉(zhuǎn)運明顯抑制(均為P＜0.05)，表明IR脂肪細胞模型建立成功，見圖1。

2.2 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞活性的影響

如表1所示，NaHS(10-5、10-4和10-3mol/L)處理IR 3T3-L1脂肪細胞12、24和48 h均沒有影響IR 3T3-L1脂肪細胞的活力(均為P＞0.05)。

圖1 高胰島素對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量和葡萄糖攝取的影響，與對照組比較，abP＜0.05

2.3 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗影響

如表2所示，與IR脂肪細胞模型組比較，NaHS (10-4和10-3mol/L)處理細胞24和48 h以時間和劑量依賴的方式增加了IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗量(均為P＜0.05)。

2.4 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取影響

NaHS(10-4和10-3mol/L)處理細胞24和48 h與IR脂肪細胞模型組比較以時間和劑量依賴的方式增加了IR 3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取量(均為P＜0.05)，見表3。

2.5 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞Glut4表達影響

與IR脂肪細胞模型組比較，NaHS(10-4和10-3mol/L)處理細胞48 h以劑量依賴的方式增加了IR 3T3-L1脂肪細胞G1ut4 mRNA和蛋白的表達(均P＜0.05)；NaHS(10-3mol/L)處理細胞24和48 h以時間依賴的方式增加了IR 3T3-L1脂肪細胞G1ut4 mRNA和蛋白的表達(均P＜0.05)。見圖2、3。

表1 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞活性的影響(ˉ±s)

表1 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞活性的影響(ˉ±s)

組別A值12 h 24 h 48 h IR脂肪細胞模型組0.28±0.04 0.27±0.03 0.31±0.02 NaHS(10-5mol/L)0.26±0.02 0.29±0.04 0.28±0.03 NaHS(10-4mol/L)0.27±0.03 0.28±0.02 0.30±0.02 NaHS(10-3mol/L)0.26±0.03 0.27±0.02 0.25±0.02

表2 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗的影響(ˉ±s)

表2 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗的影響(ˉ±s)

注:與模型組比較，aP＜0.05；與NaHS(10-5mol/L)組或12 h組比較，bP＜0.05；與24 h組比較，cP＜0.05；與NaHS(10-4mol/L)組比較，dP＜0.05

組別葡萄糖消耗量(mmol/L) 12 h 24 h 48 h IR脂肪細胞模型組2.23±0.33 2.28±0.25 2.25±0.27 NaHS(10-5mol/L)2.26±0.24 2.29±0.19 2.31±0.18 NaHS(10-4mol/L)2.28±0.31 3.16±0.25ab4.08±0.34abcNaHS(10-3mol/L)2.30±0.28 4.23±0.36abd5.14±0.39bcd

3 討論

IR是2型糖尿病、高血壓和肥胖等疾病的“共同土壤”，改善IR是防治糖尿病等疾病的重要途徑［4］。高血糖、高胰島素、高游離脂肪酸血癥和氧化應激等因素均可誘導IR［5］。本研究中用含10-7mol/L胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)液誘導3T3-L1脂肪細胞產(chǎn)生IR，結(jié)果顯示3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取量均顯著降低，表明高糖高胰島素誘導3T3-L1細胞產(chǎn)生IR。

表3 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響(±s)

表3 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響(±s)

注:與模型組比較，aP＜0.05；與NaHS(10-5mol/L)組或12 h組比較，bP＜0.05；與24 h組比較，cP＜0.05；與NaHS(10-4mol/L)組比較，dP＜0.05

組別葡萄糖攝取(cpm) 12 h 24 h 48 h IR脂肪細胞模型組1473.54±135.22 1503.61±164.74 1524.76±145.83 NaHS(10-5mol/L)1521.34±142.31 1672.11±121.73 1782.69±195.83 NaHS(10-4mol/L)1675.52±117.45 2871.45±241.56ab4586.71±387.41abcNaHS(10-3mol/L)1897.33±152.55 4765.46±426.73abd5631.85±496.24abcd

圖2 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞G1ut4 mRNA表達的影響

圖3 NaHS對IR 3T3-L1脂肪細胞G1ut4蛋白表達的影響

研究表明H2S和NO、CO一樣，符合作為細胞內(nèi)及細胞間信使物質(zhì)的標準，被認為是第三種氣體信號分子。哺乳動物細胞中的胱硫醚β合成酶、胱硫醚1裂解酶和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化可產(chǎn)生內(nèi)源性H2S［6］。H2S在體內(nèi)存在有兩種形式，即氣體H2S和NaHS形式。NaHS在體內(nèi)液體環(huán)境中可離解為鈉離子和硫氫根離子，而硫氫根離子與體內(nèi)的氫離子結(jié)合生成H2S，H2S和NaHS之間形成一種動態(tài)平衡［7］。NaHS比H2S更容易保證溶液中H2S濃度的穩(wěn)定和準確度，因此常使用NaHS作為外源性H2S的供體。H2S的生理和病理生理作用目前尚未完全闡明，它不僅在生理條件下參與了許多機體生理功能的調(diào)節(jié)，而且還參與許多疾病的病理過程［8-9］。研究表明糖尿病患者血清H2S水平明顯降低，與IR的程度呈負相關(guān)［10］。體外研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S能增加正常脂肪細胞對葡萄糖的攝?。?1］。本研究的結(jié)果顯示與IR模型組比較，外源性H2S供體NaHS顯著增加IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取量，這些表明H2S能改善脂肪細胞IR。

脂肪細胞是外周胰島素敏感組織之一，大部分葡萄糖依賴Glut4轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，胰島素結(jié)合于其受體后，通過下游的PI3K/Akt和CAP/Cbl信號轉(zhuǎn)導通路，使胞質(zhì)內(nèi)的Glut4迅速轉(zhuǎn)位至細胞膜，參與葡萄糖轉(zhuǎn)運。這一轉(zhuǎn)導通路上的缺陷是導致IR的重要原因［12］。本研究的結(jié)果顯示，伴有IR的3T3-L1脂肪細胞中Glut4的表達明顯降低，而NaHS處理顯著增加了IR的3T3-L1細胞中Glut4的表達。這些結(jié)果表明H2S改善IR的作用可能是通過上調(diào)IR的3T3-L1細胞中Glut4的表達而最終實現(xiàn)的。

總之，外源性H2S改善了高糖高胰島素誘導的脂肪細胞的IR，其機制可能與H2S上調(diào)Glut4的表達有關(guān)。

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Effects of extrogenous hydrogen su lfide on the exp ression of glucose transporter 4 in 3T3-L1 adipocytes w ith insulin resistance

Yang Feike1，Liu Jingfang1，Chen Wei1，He Xinping1，Lu Guijing2.
1 Department of Geriatric Medicine，Changsha Central Hospital，Changsha 410004，China；2 Department of Cardiovascular Medicine，Xiangya Hospital，Central South University

Objective To investigate the effect of extrogenous hydrogen sulfide(H2S)on the expression of glucose transporter 4(Glut4)in 3T3-L1 adipocytes with insulin resistance and explore the mechanism.M ethods 3T3-L1 adipocytes were incubated with high glucose and insulin to induce insulin resistance.The cells were treated with different concentrations of sodium bisulfide(NaHS)(10-5，10-4and 10-3mol/L)for 12，24 and 48 h.MTT assay was used to detect the cell viability.The glucose consumption in the medium was measured by glucose oxidase method.The glucose uptake was tested by 2-deoxy-［3H］-D-glucose method.The mRNA and protein expressions of Glut4 were measured by Real-time PCR and Western-Blot.Results Compared with control group，the glucose consumption and uptake and expressions of Glut4 were significantly decreased in the IR model group(all P＜0.05).Compared with control group，NaHS(10-5，10-4and 10-3mol/L)did not affect the cell viability.Compared with model group，the glucose consumption and uptake and expressions of Glut4 were significantly increased by treatment with NaHS(10-4and 10-3mol/L)for 24 and 48 h(all P＜0.05).Conclusions Extrogenous H2S improves IR induced by high glucose and insulin in 3T3-L1 adipocytes，and the mechanism may be related with up-regulation of Glut4 by H2S.

Hydrogen sulfide； Insulin resistance； High glucose； High insulin； Glucose transporter type 4

Liu Jingfang，Email:yangfeike@126.com

2013-12-10)

(本文編輯:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.016

長沙科技計劃項目(K120749-31)

410004長沙市中心醫(yī)院老年醫(yī)學科(楊非柯、劉竟芳、陳偉、何新平)；中南大學湘雅醫(yī)院心血管內(nèi)科(盧桂靜)

劉竟芳，電子信箱:yangfeike@126.com

This work was supported by a grant from the Epidemiological Investigation of Geriatric Diseases and Community-Based Interventions in Changsha City(No.K120749-31)