鄧永超 劉煜敏

缺血性腦血管病尤其是腦缺血后的再灌注損傷對人類健康危害較大。研究表明藥物后處理可產(chǎn)生與缺血后處理類似的腦保護作用，因藥物后處理可操作性強，更具有臨床意義。已經(jīng)證實銀杏提取物EGb761對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護作用［1］。腦組織微管相關(guān)蛋白（MAP2）作為神經(jīng)細胞的骨架成分，參與神經(jīng)元的生長和損傷后的修復(fù)過程，同時對缺血也極其敏感［2］。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，并用銀杏葉提取物進行后處理，然后觀察缺血再灌注腦組織中MAP2的表達水平來探討銀杏葉提取物對神經(jīng)的保護作用及其機制，為其治療腦缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏葉提取物（EGb761）（德國Schwade制藥公司）；Western Blotting Ecl試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）；兔抗鼠MAP2多克隆抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔多克隆抗體（美國Cell Singling公司）。

1.2 動物分組與模型建立

健康雄性SD大鼠30只，體重300～320 g，由武漢大學(xué)動物中心提供。實驗前禁食12 h，自由飲水，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為3組，即假手術(shù)組（n＝10）：給予5 ml生理鹽水腹腔注射；對照組（n＝10）：缺血90 min，再灌注24 h，5 ml生理鹽水腹腔注射；實驗組（n＝10），缺血90 min，再灌注24 h，在再灌注即刻大鼠腹腔注射20 mg／kg銀杏葉提取物稀釋5 ml。

采用線栓（Longa）法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型［3］。經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）實施麻醉，每隔90 min追加注射20 mg／kg；頸部備皮、消毒，取頸正中切口，暴露和游離右側(cè)頸總動脈，并置入尼龍線栓，經(jīng)動脈分叉推送線栓進入頸內(nèi)動脈，遇到阻力明顯表明線栓頭端已阻斷大腦中動脈，阻斷90 min，再灌注24 h。

1.3 指標測定

1.3.1 于再灌注24 h后進行神經(jīng)功能缺損評分（NDS）［3］：0級，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1級，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空時不能伸展左前肢；2級，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走時向左側(cè)偏轉(zhuǎn)；3級，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走時向左側(cè)傾倒；4級，昏迷，不能自行行走。

1.3.2 大鼠腦組織－20℃冷凍30 min，冠狀位切割成厚度為2 mm的薄片，經(jīng)1%TTC染色20 min，10%甲 醛 固 定24 h。采 用Image－Pro Plus 5.02圖像分析軟件計算腦梗死體積（測定的腦梗死體積／同側(cè)大腦半球體積×100%）。

1.3.3 采用蛋白印跡分析技術(shù)測定缺血側(cè)和健側(cè)腦組織MAP2表達水平 取大鼠腦缺血側(cè)和對側(cè)組織標本，全層皮質(zhì)稱重，每100 mg腦組織加1 mL裂解液制備組織勻漿，離心取上清液定量。經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)膜后進行封閉和雜交，一抗為兔抗大鼠MAP2抗體（1∶1000）孵育1 h，二抗為辣根過氧化酶標記的山羊抗兔多克隆抗體（1∶1000）孵育1 h，采用辣根過氧化物酶HRP－ECL發(fā)光法進行顯色。采用Image—Pro Plus 5.02圖像分析軟件對上述顯影的X線片做圖像灰度掃描，將假手術(shù)組腦組織MAP2蛋白條帶灰度的平均數(shù)設(shè)為正常值，各組腦組織MAP2表達水平以其蛋白條帶灰度值與正常值的百分比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均在SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠NDS評分

假手術(shù)組、對照組和實驗組大鼠NDS評分分別為（0.18±0.05）分、（2.49±0.85）分 和（1.58±0.62）分，對照組和實驗組NDS評分較假手術(shù)組均顯著升高，實驗組NDS評分較對照組明顯下降，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠腦梗死體積比較

與假手術(shù)組比較，對照組、實驗組腦梗死體積均顯著增大；與對照組比較，實驗組腦梗死體積顯著減小，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 3組大鼠腦梗死體積與同側(cè)大腦半球體積的比值比較（ˉx±s，n＝5，%）

2.3 3組大鼠腦組織MAP2蛋白的表達水平

與假手術(shù)組比較，對照組、實驗組缺血側(cè)MAP2蛋白的表達水平均顯著降低；與對照組比較，實驗組缺血側(cè)MAP2蛋白的表達水平顯著升高，3組間比較差異均明顯（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠MAP2蛋白表達水平的比較（ˉx±s，n＝5，%）

3 討 論

機體組織器官正常代謝、功能的維持依賴于良好的血液供應(yīng)?，F(xiàn)如今腦血管病是臨床首位致殘因素，其中缺血性腦血管病約占全部腦卒中的70%。缺血性腦血管病尤其是缺血后的再灌注損傷對人類健康危害較大。研究表明缺血后處理和預(yù)處理一樣，可以通過減少氧自由基途徑而有效減輕缺血再灌注損傷，尤其在早期，而且比預(yù)處理更有效調(diào)控［4，5］。藥物后處理作為其重要方式，以其無創(chuàng)優(yōu)點顯示出更好的前景。王小姍等人采用銀杏提取物EGb761混合處理后發(fā)現(xiàn)其具有腦缺血保護作用［6］。故本研究采用銀杏提取物EGb761后處理來探討其腦保護作用及其機制。

本實驗結(jié)果表明大鼠腦缺血再灌注損傷予以銀杏提取物EGb761處理后明顯降低NDS評分，改善大鼠腦梗死后的神經(jīng)功能癥狀。微管相關(guān)蛋白2（MAP2）是神經(jīng)細胞的骨架成分，在大鼠的神經(jīng)元中表達豐富，MAP2參與神經(jīng)元的生長和損傷的修復(fù)過程，對缺血相當(dāng)敏感［7，8］。MAP2表達增強則有助于維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性，是神經(jīng)元的保護反應(yīng)，提示神經(jīng)元對傷害性刺激耐受性提高，這可能與NMDA受體活性相關(guān)［8］。MAP2減少被認為是缺血神經(jīng)元Ca2＋內(nèi)流增加、激活鈣調(diào)蛋白水解酶和水解細胞骨架蛋白的結(jié)果［9］。本研究結(jié)果表明經(jīng)銀杏葉提取物EGb761后處理后能明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)缺損，減少腦梗死體積，MAP2表達水平明顯升高。對于銀杏葉提取物對腦保護的研究，Tang等研究認為銀杏提取物能部分恢復(fù)實驗鼠腦海馬回記憶和乙酰膽堿活性，但不能恢復(fù)生長激素釋放抑制激素水平，由此推論銀杏提取物通過影響膽堿能系統(tǒng)來保護大腦免受β－淀粉樣蛋白的損傷［10］。另外，銀杏提取物可通過抑制膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白（GFAP）的生成及減少促凋亡基因bax的表達［11］，抑制血小板活化蛋白（PAF）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達［12］來減輕缺血再灌注損傷。本研究證實了銀杏提取物后處理在缺血再灌注24 h后的神經(jīng)保護效果，但未對銀杏提取物后處理的神經(jīng)保護作用進行長期觀察，這種保護作用是否持續(xù)存在以及保護機制的作用靶點如何等還有待深入研究。

總之，銀杏提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護效應(yīng)，其效應(yīng)可能與MAP2蛋白表達水平升高有關(guān)。

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12段長虹，付慶林，蘄國慶，等.銀杏提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和血小板活化因子表達的影響.中華實驗外科雜志，2012，29（2）：259－261.