趙迎晨　孔小平　朱　茜　袁曉麗

(河南省計量科學(xué)研究院，鄭州 450008)

0　引言

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(以下簡稱儀器)因其準(zhǔn)確的定性和定量能力，在食品、環(huán)境、生命科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣。國家標(biāo)準(zhǔn)中利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的分析方法逐年增多，從而使該儀器成為許多實驗室的常規(guī)檢測設(shè)備。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀原理復(fù)雜，技術(shù)先進，多為進口廠家，軟件操作復(fù)雜，對計量校準(zhǔn)人員的知識水平要求較高。JJF 1317—2011僅對液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的校準(zhǔn)做出了指導(dǎo)性的說明，本文將結(jié)合儀器基本原理，介紹校準(zhǔn)前的準(zhǔn)備工作、注意事項，校準(zhǔn)過程中遇到的技術(shù)問題及解決方法。

1　測量原理

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是將液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用的儀器，用于樣品定性定量分析。樣品通過液相色譜分離后的各個組分依次進入質(zhì)量檢測器，各組分在離子源被電離，產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)不同的離子。不同離子在電磁場中的運動行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比(m/z)把離子分開，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析處理，可以得到樣品的定性和定量結(jié)果。圖1為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的基本組成。

圖1　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀基本組成

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀主要包括液相色譜系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、真空系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理和化學(xué)工作站等部分。離子源主要有大氣壓電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)等；質(zhì)量分析器分為單四極桿(Q)、三重四級桿(QQQ)、離子阱(IT)和飛行時間質(zhì)量(TOF)分析器等幾種。

2　校準(zhǔn)前準(zhǔn)備工作

2.1　真空度

對液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的校準(zhǔn)，需要提前抽真空，真空度達(dá)到儀器使用要求后方可進行校準(zhǔn)。由于質(zhì)譜儀檢測的是氣相離子，離子要在電場、磁場或者電磁場中飛行一定的時間和空間才能到達(dá)檢測器，如果這些時間和空間中存在大量的氣體分子，分析的離子就會與氣體分子發(fā)生碰撞而淬滅。所以，真空不僅是質(zhì)譜正常運行的基本條件，也是保證儀器靈敏度重要因素之一。

2.2　質(zhì)量校正

儀器長時間關(guān)機再使用，對質(zhì)量軸、預(yù)四極桿進行過清洗或維護，環(huán)境溫度變化較大，都有可能引起質(zhì)量軸的偏移，此時需使用調(diào)諧液對質(zhì)量進行校正。不同儀器廠家采用的調(diào)諧液不同，根據(jù)具體情況進行確定。常見種類有PPG(聚丙二醇)、碘化鈉銫等溶液。

校準(zhǔn)之前注意調(diào)用正確的調(diào)諧文件，筆者在工作中遇到Agilent6460質(zhì)譜儀做質(zhì)量準(zhǔn)確性時，利血平的母離子質(zhì)荷比(m/z)為606，檢查后發(fā)現(xiàn)儀器自帶的調(diào)諧液過期，自動調(diào)諧校準(zhǔn)質(zhì)量軸的時調(diào)諧(Tune)不通過，儀器錯誤的調(diào)用生成的失敗調(diào)諧文件。換新的調(diào)諧液重新調(diào)諧后問題就解決了。

3　質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

開始校準(zhǔn)之前，要優(yōu)化目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)。一般采用濃度1μg/mL的利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以流動注射的方式或者經(jīng)液相色譜系統(tǒng)進樣對質(zhì)譜儀的參數(shù)進行優(yōu)化。采用流動注射的方式優(yōu)化時，最好是采用三通裝置，流動相設(shè)置為校準(zhǔn)的條件，使流動相和利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合后一塊進入質(zhì)譜系統(tǒng)。在具體工作中發(fā)現(xiàn)，不同廠家的儀器具體操作時有很大的差別，下面以正離子模式的電噴霧電離(ESI+)模式為例，對校準(zhǔn)工作中碰到的儀器進行說明。

3.1　WatersXevoTQ串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀

質(zhì)譜部分帶有自動優(yōu)化功能，校準(zhǔn)時將利血平溶液放到儀器指定位置，在Tune界面下選擇液相和樣品混合進樣，參照儀器的操作說明，輸入利血平的分子量608.3或者分子式C33H40N2O9，子離子個數(shù)先選擇兩個，因為利血平主要子離子就是195(m/z)和397(m/z)。然后點擊開始自動調(diào)諧，就會生成保存儀器的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)方法，調(diào)用方法時，選擇生成子離子195(m/z)的質(zhì)譜條件。

3.2　Agilent6400系列質(zhì)譜儀

儀器一般都沒有配置流動注射裝置，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)時需要采用液相系統(tǒng)，液相條件參照規(guī)范說明進行配置，為了節(jié)省時間，可以采用二通管代替色譜柱。首先進行母離子的掃描，選擇單四級桿掃描(MSScan)模式確定母離子的m/z，碰撞誘導(dǎo)解離電壓(Fragmentor)一般為100多伏。在選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)的模式下，輸入母離子的m/z，優(yōu)化Fragmentor，保證母離子的最大傳輸效率，一般從100V到200V間隔20V進行優(yōu)化。最后在子離子掃描(production)模式下，輸入母離子的m/z，最優(yōu)Fragmentor值，設(shè)置不同的碰撞電壓(CE)值，獲得不同碎裂能量下的子離子，從而找到子離子195(m/z)最大響應(yīng)時的CE值。一般在30±10電子伏特范圍內(nèi)進行優(yōu)化。如果在最優(yōu)的參數(shù)下，儀器的靈敏度仍不夠，那就增大電子倍增器電壓(EMV)到獲得合適的響應(yīng)。

3.3　Thermo TSQ質(zhì)譜儀

在Tune Master窗口中點擊On/Standby按鈕，開啟質(zhì)譜儀。把利血平溶液裝入到蠕動泵上的注射器上，通過peek管連到三通管和經(jīng)液相出來的流動相混后進入質(zhì)譜中。在選擇離子掃描(Scan Type)模式中選擇全離子掃描(Full Scan)模式進行母離子的優(yōu)化，在此過程中可以選擇顯示輪廓圖還是棒狀圖，選擇輪廓圖得到利血平母離子609(m/z)的半峰寬，進行分辨力的校準(zhǔn)。對于利血平母離子從609(m/z)到195(m/z)的選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，可以在Tune Master中的Control/Scan Mode工具欄上點擊Compound Optimization Workspace，選擇Optimization Modes：選擇SRM按鈕就可以自動完成優(yōu)化。在進行一級質(zhì)譜優(yōu)化時，要留意參數(shù)優(yōu)化是否成功。氣壓或真空度不夠，會出現(xiàn)優(yōu)化失敗的情況，但仍可以繼續(xù)優(yōu)化。優(yōu)化時，母離子必須達(dá)到規(guī)定的強度才能說明利血平離子是穩(wěn)定存在的，這樣才能保證各個參數(shù)優(yōu)化的準(zhǔn)確性。

3.4　AB SCIEX API系列

在軟件導(dǎo)航欄的調(diào)諧(Tune)模式有兩個作用：1)儀器全局參數(shù)的尋找，比如分辨率優(yōu)化，質(zhì)量數(shù)校準(zhǔn)；2)分析方法的建立，比如母離子，子離子的尋找，選擇SRM的參數(shù)優(yōu)化等。實際校準(zhǔn)工作當(dāng)中，提前讓儀器操作人員用PPG對儀器進行質(zhì)量數(shù)相關(guān)參數(shù)的校準(zhǔn)。對于校準(zhǔn)工作，先用濃度大約0.1～1.0μg/mL的標(biāo)樣，通過注射泵(syringe pump)，采用流動注射分析(FIA)的方式，以5～10μL/min的流速，通過三通管和液相流動相混合后進入質(zhì)譜，優(yōu)化化合物(COMPOUND)項下面的參數(shù)，如去簇電壓(DP)、聚焦電壓(CE)、入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓(CXP)及碰撞活化解離(CAD)等，在保證充分樣品離子化基礎(chǔ)上，DP低些使母離子豐度提高，總靈敏度相應(yīng)也會提高。

4　校準(zhǔn)過程及主要問題解決方法

4.1　分辨力和質(zhì)量準(zhǔn)確性

分辨力的校準(zhǔn)要選擇輪廓圖，規(guī)范上說校準(zhǔn)時直接注入或經(jīng)液相系統(tǒng)注入5ng利血平。此處有些不妥，采用流動注射方式直接注入時，除了注入樣品濃度外無法知曉注入質(zhì)譜系統(tǒng)中利血平的質(zhì)量。校準(zhǔn)分辨力項目時規(guī)范建議采用100pg/μL的利血平標(biāo)準(zhǔn)濃度，注入5ng利血平需要50μL的進樣量，對于液相系統(tǒng)這個進樣量太大了。另外，由于超高效液相色譜(UPLC)和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展，經(jīng)液相系統(tǒng)注入5ng利血平就容易造成質(zhì)譜檢測器飽和，造成母離子609(m/z)質(zhì)譜圖出現(xiàn)平頭峰。建議去掉注入5ng利血平的說明，改為根據(jù)實際情況采用100pg/μL或者10pg/μL的利血平標(biāo)準(zhǔn)濃度進行分辨力的校準(zhǔn)。采用流動相進行稀釋可以提高分離度，得到的峰形尖銳、對稱。

質(zhì)量準(zhǔn)確性的校準(zhǔn)可以與分辨力的校準(zhǔn)過程結(jié)合進行。質(zhì)譜采集時最好選擇棒狀圖模式。在校準(zhǔn)過程中，可以通過利血平母離子m/z與理論值609.28(m/z)的差別來判斷儀器的質(zhì)量軸是否校準(zhǔn)好，以此來及時發(fā)現(xiàn)問題，并采取相應(yīng)措施。

4.2　離子豐度比重復(fù)性

此項校準(zhǔn)針對質(zhì)量分析器為離子阱的質(zhì)譜。離子阱質(zhì)譜的主要優(yōu)勢是定性，定量能力較差。校準(zhǔn)時首先選擇適當(dāng)?shù)呐鲎材芰?CE)，使兩個離子豐度比值在40%～150%之內(nèi)，然后經(jīng)色譜柱注入500pg利血平，經(jīng)一級裂解記錄397(m/z)和448(m/z)的豐度比。

4.3　信噪比、峰面積重復(fù)性與保留時間重復(fù)性

校準(zhǔn)時，一般前幾針進樣重復(fù)性都不太理想，進樣系統(tǒng)穩(wěn)定后，取最后的連續(xù)6次作為測量結(jié)果進行計算。利血平的出峰時間一般都在5min以內(nèi)，工作當(dāng)中可能會碰到?jīng)]有峰的情況，進幾針以后如果還是沒有峰出現(xiàn)，就要考慮是不是液相條件設(shè)置有問題，在校準(zhǔn)工作中筆者發(fā)現(xiàn)有操作人員錯誤使用80%水的情況，導(dǎo)致利血平樣品在色譜柱里洗脫不出來。

另外，JJF 1317—2011中，信噪比的測定條件只給出了進樣量，在附錄C中給出了校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)液濃度所對應(yīng)校準(zhǔn)項目，校準(zhǔn)時按照附錄C中建議方法進行。根據(jù)經(jīng)驗，進樣體積超高效液相色譜(UPLC)2～5μL為最佳，高效液相色譜(HPLC)5～10μL為最佳，因為一般液體使用的色譜柱內(nèi)徑比較小，柱體積也小，進樣體積太大會造成色譜柱飽和，影響分離效果。

目前儀器工作站一般有信噪比計算功能?；€噪聲的定義有三種：峰/峰(peak to peak)信噪比、峰/半峰(half peak to peak)信噪比和均方根(RMS)信噪比。使用工作站信噪比功能時，要清楚儀器采用的噪聲計算方式。根據(jù)JJF 1317—2011，應(yīng)選擇峰/峰信噪比，注意6次結(jié)果要選擇相同時間段的噪聲。峰面積重復(fù)性與保留時間重復(fù)性的測定，注意質(zhì)譜條件中駐留時間(Dwell Time)的設(shè)置。駐留時間太長，色譜峰采樣點太少，重現(xiàn)性下降，駐留時間太短，噪聲會增高，信噪比降低。一般一個色譜峰，至少8點以上。另外，質(zhì)譜軟件一般都帶有平滑功能，進行信噪比計算時，建議不要采用平滑功能，這樣會平滑掉噪聲，人為的增加儀器的信噪比。在考察峰面積重復(fù)性與保留時間重復(fù)性的時候，可以采用平滑功能。

5　結(jié)束語

儀器計量校準(zhǔn)是一項細(xì)致而復(fù)雜的工作，特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的校準(zhǔn)，影響因素多，涉及面廣。掌握儀器的基本結(jié)構(gòu)以及工作原理，提高自己的知識業(yè)務(wù)水平，才能在工作中遇到實際問題時，找到解決的方法，從而有效地保證計量校準(zhǔn)工作的質(zhì)量。

[1]盛龍生，蘇煥華，等.色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012

[2]Michal H,Robert J,Miroslav L,Recent developments in liquid chromatography-mass spectrometry and related techniques[J].Journal of Chromatography A,2012,1259:3-15.

[3]戴新華，等.液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定血清中的尿酸[J].計量技術(shù),2008(10)

[4]JJF 1317—2011液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)規(guī)范[S].北京：中國計量出版社，2011

[5]JJF 1094—2002測量儀器特性評定[S].北京：中國計量出版社，2003