楊　洋　張國城

(北京市計量檢測科學(xué)研究院，北京 100029)

0　引言

液相色譜儀熒光檢測器是一種高靈敏度檢測器，常用于食品、藥品等行業(yè)中的痕量物質(zhì)分析。其被檢測對象要求具有熒光特性，而物質(zhì)的熒光特性又受溶劑極性、酸度等因素的影響。JJG 705—2002《液相色譜儀》國家計量檢定規(guī)程選擇硫酸奎寧/高氯酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對液相色譜儀-熒光檢測器的計量指標(biāo)進(jìn)行檢測，包括儀器的檢出限、定性定量重復(fù)性等。這是因為硫酸奎寧的熒光產(chǎn)率高，化合物穩(wěn)定，且吸收光譜和發(fā)生光譜重疊小，常作為標(biāo)準(zhǔn)用于計算其他熒光物質(zhì)的熒光產(chǎn)率。但是大量的計量實踐經(jīng)驗表明，如果按規(guī)程所選用的85%甲醇/水的流動相進(jìn)行檢測，得到的硫酸奎寧的色譜峰經(jīng)常不理想，峰形既不對稱也不規(guī)則，而且伴有一個或多個肩峰，甚至有些儀器在做重復(fù)性檢測時，峰形不斷變化，導(dǎo)致峰面積重復(fù)性結(jié)果不佳。因此，我們研究了流動相對硫酸奎寧檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)65%甲醇/水作為流動相效果更好，為廣大計量工作者提供有益的參考。

1　流動相對峰形的影響

參照J(rèn)JG 705—2002檢定規(guī)程設(shè)置儀器相關(guān)參數(shù)，流速1mL/min，激發(fā)波長345nm，發(fā)射波長455nm，選擇不同比例的甲醇/水做流動性，對1×10-6g/mL的硫酸奎寧進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果表明，如果改變流動相中甲醇和水的比例，色譜峰峰形也會發(fā)生變化。以Agilent公司的1260 Infinity儀器(G1321B熒光檢測器)為例，檢測了甲醇比例由100%、85%、75%變化到65%得到的色譜峰的結(jié)果，見圖1。在純甲醇中，硫酸奎寧色譜峰有較長的拖尾(在有些儀器中拖尾由幾個肩峰組成)。隨著甲醇比例的減少，右側(cè)的肩峰逐漸升高，在75%時變成主峰，到65%時肩峰消失，得到很規(guī)則對稱的色譜峰。如果甲醇比例降到50%，則色譜峰變窄變高，表現(xiàn)出更好的柱效。

圖1　甲醇比例的變化對硫酸奎寧色譜峰的影響

雖然不同廠家和不同型號的熒光檢測器，其在相同參數(shù)下觀察得到的色譜峰形不太相同，但是在甲醇為比例100%～75%，色譜峰形基本在圖1中a～c的基礎(chǔ)上變化；在65%甲醇/水中，能觀察得到類似圖1d的規(guī)則對稱的色譜峰。

2　流動相對峰面積和峰高的影響

流動相對硫酸奎寧色譜峰峰形的影響，將直接影響到色譜峰的峰面積和峰高。以1×10-6g/mL的硫酸奎寧為例，采用C18色譜柱，儀器其他參數(shù)參照J(rèn)JG 705—2002檢定規(guī)程，進(jìn)樣量為10μL。雖然不同儀器觀測得到的結(jié)果有所差異，但是變化趨勢卻是一樣的，見表1和表2。規(guī)程方法所選擇的85%甲醇/水，得到的峰面積和峰高卻是最低的。如果各個流動相條件下得到的峰面積與峰高，分別除以85%甲醇/水得到的峰面積和峰高，可以得到不同甲醇比例下的峰面積比和峰高比。隨著甲醇比例的進(jìn)一步降低，峰面積有所變化，但峰高增加更顯著，說明峰變得更窄更規(guī)則。

表1　流動相對色譜峰參數(shù)的影響(Agilent G1321B檢測器)

表2　流動相對色譜峰參數(shù)的影響(Waters 2475檢測器)

3　流動相對檢出限的影響

流動相不同，儀器基線噪聲變化不顯著(假設(shè)不變)(本實驗Agilent G1321B和Waters 2475檢測器觀察到的噪聲分別為0.0015LU和0.05EU)，但是色譜峰峰高受影響，必然影響儀器的檢出限，見表3。可以看出流動相對低濃度硫酸奎寧峰的影響與高濃度情況類似，在65%甲醇/水比例中能得到更好的檢出限。

表3　流動相對檢出限的影響

4　討論

4.1　流動相極性對熒光的影響

流動相中甲醇/水比例的影響，可歸結(jié)為溶劑極性對硫酸奎寧熒光的影響。隨著溶劑極性的增加，硫酸奎寧的p →p*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增加。隨著甲醇比例降低，流動相黏度增加，會減少熒光分子間碰撞機(jī)會，使無輻射躍遷幾率減少而使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。而且流動相比例的變化，會影響硫酸奎寧形成的氫鍵，并使硫酸奎寧的電離狀態(tài)改變，從而改變硫酸奎寧的熒光強(qiáng)度。

4.2　甲醇比例的受限性

甲醇和水混合，在流速相同時，當(dāng)純水或純甲醇時，柱壓是最低的，兩者混合后，壓力會升高，直到兩者比例相差不多時，壓力最高。以Agilent 1260 Infinity(15cm的C18分離柱，流速1.0ml/min)為例，當(dāng)甲醇比例由100%、85%、75%變化到65%時，系統(tǒng)壓力由8.0MPa、11.6MPa、13.5MPa變化到15.4MPa。當(dāng)甲醇與水的比例接近1/1時，流動相黏度達(dá)到最大(常用于洗針)，柱子壓力能達(dá)到28.0MPa以上，對柱子損害較大。所以流動相一定要避免使用這個范圍的甲醇/水比例。因此進(jìn)一步降低甲醇比例，雖然能提高硫酸奎寧色譜峰的峰高和對稱性，但是會對儀器造成損害，所以65%甲醇/水是比較合適的選擇。

5　結(jié)論

在液相色譜儀熒光檢測器的檢測過程中，硫酸奎寧的色譜峰的峰形、峰面積和峰高受流動相中甲醇/水比例影響顯著，從而影響儀器的檢出限等計量指標(biāo)。實踐表明，如果流動相選用的甲醇/水比例為65:35時，檢測得到峰形及儀器檢出限往往優(yōu)于JJG 705—2002規(guī)程所選用的85:15的甲醇/水所得到的檢測結(jié)果。

[1]JJG 705—2002液相色譜儀計量檢定規(guī)程

[2]元天佑.化學(xué)計量.北京：原子能出版社，2002

[3]艾明澤，肖哲主編.化學(xué)計量.北京：中國計量出版社，2007

[4]李瑞驥.硫酸奎寧溶液螢光光譜的測定.廣醫(yī)通訊，1980(2)

[5]楊根元.實用儀器分析(第4版).北京：北京大學(xué)出版社，2010