徐吉洋，張文萍，李少南 ，侯式娟

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所 杭州 310029

毒死蜱是一種含氮雜環(huán)類(lèi)有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)殺螨劑，對(duì)害蟲(chóng)具有觸殺、胃毒和熏蒸作用?？捎糜诜乐蔚撅w虱、稻縱卷葉螟等百余種大田作物害蟲(chóng)，以及家畜寄生蟲(chóng)等[1]。作為對(duì)于高等動(dòng)物毒性相對(duì)較低的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，毒死蜱有著廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，毒死蜱全球銷(xiāo)量在有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑中始終排名第一，在所有殺蟲(chóng)劑中穩(wěn)居前三位。該農(nóng)藥在我國(guó)的年產(chǎn)量現(xiàn)已超過(guò)4萬(wàn)噸[2]。隨著使用量的增加，毒死蜱親體及代謝產(chǎn)物有可能通過(guò)多種途徑進(jìn)入地表水。Hall等[3]報(bào)道了美國(guó)the San Joaquin River Watershed1991-2001近十年間地表水中毒死蜱的檢測(cè)數(shù)據(jù)，其濃度為0.09～337×10-3mg·L-1。在澳大利亞南澳州的Mt. Lofty Ranges，Danielle 等[4]測(cè)得蘋(píng)果園和櫻桃園附近地表水中毒死蜱殘留濃度在0.02～0.11×10-3mg·L-1的范圍內(nèi)變化。在西班牙地中海沿岸瀉湖Mar Menor的入水口，Campillo等[5]測(cè)得毒死蜱濃度變化范圍介于18.9～23.0×10-3mg·L-1之間，平均濃度為1.83×10-3mg·L-1。在該湖的水體中，Moreno-Gonzalez等[6]測(cè)得毒死蜱濃度變化范圍介于0.8～8.9×10-3mg·L-1。在泰國(guó)的Mea Sa流域，Sangchan等[7]在5月和8月測(cè)得上游水樣中毒死蜱濃度變化范圍介于0.08～0.65×10-3mg·L-1之間，下游水樣中毒死蜱濃度變化范圍介于0.04～0.2 ×10-3mg·L-1之間。在我國(guó)，吳長(zhǎng)興等[8]按照推薦劑量施藥之后，測(cè)得毒死蜱在稻田“出水”中的殘留水平最高達(dá)到2.61×10-2mg·L-1；從河流引入的灌溉水中，毒死蜱殘留最高達(dá)到3.23×10-3mg·L-1。可見(jiàn)毒死蜱在水體中的廣泛存在是個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)。至于該農(nóng)藥對(duì)于水生動(dòng)物的毒性，以往對(duì)魚(yú)類(lèi)有較多研究[9-11]。節(jié)肢動(dòng)物當(dāng)中，除了大型溞[12-13]，對(duì)于其他物種的研究還不夠充分。本文參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)“化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”所提供的方法，以大型溞、老年低額溞、多刺裸腹溞、鋸緣真劍蚤、介形蟲(chóng)、花翅搖蚊幼蟲(chóng)作為受試生物，開(kāi)展48 h急性毒性試驗(yàn)，以探明毒死蜱對(duì)于水生節(jié)肢動(dòng)物的急性毒性，為該農(nóng)藥在水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物

以大型溞Daphniamagna、多刺裸腹溞Moinamacrocopa、老年低額溞Simocephalusvetulus、鋸緣真劍蚤Eucyclopsserrulatus、介形蟲(chóng)Pseudocandonasp.、花翅搖蚊ChironomuskiiensisTokunaga (1936) 東洋區(qū)廣布種作為受試生物。大型溞來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所(原中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生和衛(wèi)生工程研究所)，屬于62 DM生物株。其余物種均采自浙江大學(xué)華家池校區(qū)人工湖。采回的生物經(jīng)過(guò)物種分離純化之后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)至少3代(其中裸腹溞和低額溞采用孤雌生殖的后代)。3種溞在pH 7.8～8.9、電導(dǎo)率590～600 μs·cm-1的M4培養(yǎng)液[14]中進(jìn)行培養(yǎng)，劍水蚤、介形蟲(chóng)和花翅搖蚊培養(yǎng)在pH 7.3～7.4、電導(dǎo)率240～250 μs·cm-1的曝氣自來(lái)水中。

1.2 受試農(nóng)藥與儀器

以純度為97%的毒死蜱(chlorpyrifos)原藥(浙江新農(nóng)化工股份有限公司產(chǎn)品)作為受試藥劑。島津GC 2010(日本)，帶ECD檢測(cè)器，用于農(nóng)藥殘留分析。

1.3 急性毒性試驗(yàn)方法

大型溞等5種甲殼綱浮游動(dòng)物的試驗(yàn)方法參照OECD“化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則202”[15]。屬于昆蟲(chóng)綱的花翅搖蚊幼蟲(chóng)的試驗(yàn)方法參照OECD“化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則235”[16]。溞類(lèi)試驗(yàn)以上述M4培養(yǎng)液作為稀釋水，劍水蚤、介形蟲(chóng)和花翅搖蚊幼蟲(chóng)試驗(yàn)采用上述曝氣自來(lái)水作為稀釋水。先用丙酮將原藥配成母液，再用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。各濃度組稀釋液中丙酮的終濃度不超過(guò)0.1 mL·L-1。設(shè)空白和溶劑(丙酮)兩組對(duì)照。溶劑對(duì)照中丙酮的終濃度與最高濃度組相同。溞類(lèi)采用出生24 h幼體，花翅搖蚊采用2齡幼蟲(chóng)，劍水蚤和介形蟲(chóng)采用帶卵成蟲(chóng)作為受試生物。試驗(yàn)歷時(shí)48 h。試驗(yàn)期間的水溫控制在22～24 ℃,每日光照時(shí)間控制在16 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)5頭供試生物。

我國(guó)環(huán)保部頒布的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”[17]將化學(xué)農(nóng)藥對(duì)溞類(lèi)的毒性劃分為3個(gè)等級(jí)： LC50≤1 mg·L-1為高毒，1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。我國(guó)農(nóng)業(yè)部采用的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”將化學(xué)農(nóng)藥對(duì)溞類(lèi)的毒性劃分為4個(gè)等級(jí)： LC50≤0.1 mg·L-1為劇毒，0.1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。

1.4 稀釋液中毒死蜱含量測(cè)定

1.4.1 取樣及樣品前處理

從每一濃度組取150 mL稀釋液，輕輕震蕩使之均勻混合。用量筒準(zhǔn)確量取100 mL，轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗中，加5% NaCl 50 mL，再加100 μL甲酸(≥88.0 %)，分別用50 mL二氯甲烷萃取3次，下層有機(jī)相過(guò)無(wú)水硫酸鈉，收集于250 mL平底燒瓶中，再用10～15 mL二氯甲烷淋洗無(wú)水硫酸鈉，淋洗液一并匯入平底燒瓶。將上述萃取液在40 ℃水浴上減壓濃縮至干，用2 mL乙酸乙酯溶解殘留物，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，待測(cè)。

1.4.2 檢測(cè)條件

進(jìn)樣口溫度：240 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；載氣：高純N2(99.999%)；進(jìn)樣模式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL；色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱(0.32 mmID×30 m，0.25 μm df)；升溫程序：150 ℃保持2 min，15 ℃·min-1升至190 ℃，保持1 min，5 ℃·min-1升至240 ℃。毒死蜱在上述條件下的保留時(shí)間大約為7.7 min(圖1)，最小檢測(cè)濃度為0.1 μg·L-1。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用乙酸乙酯作為溶劑，配成濃度為100 mg·L-1的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液(母液)，再依次稀釋到0.5 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.005 mg·L-1、0.001 mg·L-1。按照“1.3.2”所提供的條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 1 923 606.9X+29 610.068，R2=0. 9984。

1.4.4 添加回收率

按照“1.4.2”所提供的條件進(jìn)行測(cè)定，毒死蜱在曝氣自來(lái)水中和M4培養(yǎng)液中的添加回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。圖1顯示毒死蜱在以M4配制的稀釋液中的色譜峰。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 “劑量-反應(yīng)”關(guān)系

以用藥劑量的對(duì)數(shù)值為自變量(x)，以受試生物在相應(yīng)劑量下的死亡百分率的幾率值為因變量(y)，應(yīng)用DPS·數(shù)據(jù)處理軟件，求得“劑量_反應(yīng)”關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R、p值、LC50及其95%置信限。

1.5.2 毒死蜱實(shí)測(cè)濃度平均值

假定毒死蜱在試驗(yàn)過(guò)程中的濃度下降符合對(duì)數(shù)曲線，采用“時(shí)間加權(quán)平均法”計(jì)算毒死蜱在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中的實(shí)測(cè)濃度平均值?？梢杂孟铝泄接?jì)算對(duì)數(shù)降解曲線下的“面積”：

面積=Co-Ct/LnCo-tLnCt

其中“C0”和“Ct”分別為受試物在“0”時(shí)間和“t”時(shí)間實(shí)測(cè)濃度(單位：mg·L-1)，“t”為時(shí)間間隔(單位：h)。將“面積”除以時(shí)間間隔“t”(單位：h)，即得到受試物在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)的“時(shí)間加權(quán)平均濃度”(單位：mg·L-1)。

表1 毒死蜱在曝氣自來(lái)水和M4培養(yǎng)液中的添加回收率Table 1 Recoveries of chlorpyrifos in aerated tap water and M4 culture medium

圖1 毒死蜱在稀釋液中的氣相色譜峰(濃度：16 μg·L-1)Fig. 1 GC peaks of chlorpyrifos in dilution (Conc.: 16 μg·L-1)

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 毒性試驗(yàn)結(jié)果與討論

毒死蜱處理之后，受試溞類(lèi)表現(xiàn)為沉底，游動(dòng)少，不靈活；介形蟲(chóng)表現(xiàn)為游動(dòng)活潑；花翅搖蚊表現(xiàn)為軀體皺縮，只有頭部有輕微扣動(dòng)。

根據(jù)毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的線性方程、R值、48 h-LC50、95%置信限及毒性評(píng)價(jià)。本文在測(cè)定毒性的同時(shí)，對(duì)于稀釋液中的農(nóng)藥含量進(jìn)行了測(cè)定。從表2中可以看出，按照實(shí)測(cè)濃度計(jì)算出的LC50，與按理論濃度計(jì)算出的相應(yīng)值的差別在-14.7%～33.9%之間。無(wú)論以理論濃度，還是以實(shí)測(cè)濃度計(jì)，毒死蜱對(duì)上述六種水生節(jié)肢動(dòng)物均屬于劇毒。毒死蜱對(duì)六種水生節(jié)肢動(dòng)物的急性毒性大小順序均為：低額溞>裸腹溞>大型溞>介形蟲(chóng)>劍水蚤>花翅搖蚊幼蟲(chóng)。

毒死蜱雖屬于傳統(tǒng)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，其對(duì)于水生節(jié)肢動(dòng)物的毒性，公開(kāi)報(bào)道的研究資料仍然有限。毒死蜱對(duì)裸腹溞、劍水蚤和介形蟲(chóng)的毒性測(cè)定結(jié)果迄今未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。吳長(zhǎng)興等[8]和徐燕等[18]分別測(cè)得毒死蜱原藥對(duì)大型溞Daphniamagna幼體的48 h-LC50為1.44和3.30×10-3mg·L-1。Van Wijngaarden等[13]測(cè)得毒死蜱原藥對(duì)低額溞Simocephalusvetulus成體的48 h-LC50為0.40×10-3mg·L-1。Ali[19]測(cè)得毒死蜱原藥對(duì)搖蚊Chironomuscrassicaudatus4齡幼蟲(chóng)的24 h-LC50是0.052 mg·L-1。與前人相比，本文的毒死蜱測(cè)定結(jié)果，對(duì)大型溞和低額溞偏毒性高，對(duì)花翅搖蚊幼蟲(chóng)毒性偏低。

表2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果匯總Table 2 Summary of the acute toxicity tests

2.2 暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)表征

目前國(guó)內(nèi)外大多采用商值法對(duì)于化學(xué)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。所謂商值Q (quotient)，是指化學(xué)品在環(huán)境介質(zhì)中的沉積量與其有害劑量(例如依據(jù)“劑量—反應(yīng)”關(guān)系而得出的LC50、EC50，或通過(guò)差異顯著性分析而得出的NOEC/LOEC等)之間的比值。商值越高，化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)越大[20-21]。商值屬于無(wú)單位量綱，故作為其決定因素之一的LC50、EC50等，應(yīng)該盡可能以實(shí)測(cè)濃度(而非以名義濃度)進(jìn)行推斷。把商值集合預(yù)先劃分為若干個(gè)數(shù)值區(qū)間，區(qū)間的臨界點(diǎn)代表著不同的關(guān)注水平(levels of concern, LOC)。將求得的商值與LOC相比較，即可以對(duì)相關(guān)化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)性做出判斷。

目前人們普遍采用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型來(lái)估算化學(xué)品的環(huán)境沉積量EEC (estimated environmental concentration)。GENEEC 2.0是美國(guó)EPA發(fā)布的一款暴露分析軟件。其“場(chǎng)景”中包含一塊面積為10公頃的“施藥區(qū)”和一方面積為1公頃、深度為2 m的池塘。后者為“污染關(guān)注區(qū)”?，F(xiàn)以防治稻飛虱的720 g ai·ha-1作為推薦劑量，在“一次性噴霧”、“不設(shè)安全帶”、“施藥2 d后放水”等操作條件下，推算出毒死蜱在池塘中的初始EEC為5.38 μg·L-1(表3)。美國(guó)EPA將包括農(nóng)藥在內(nèi)的化學(xué)品的急性風(fēng)險(xiǎn)商值RQ(risk quotient)劃分為4個(gè)區(qū)間：RQ<0.05，無(wú)風(fēng)險(xiǎn)；0.05≤RQ<0.1，可能對(duì)瀕危物種有不利影響；0.1≤RQ<0.5，產(chǎn)生急性風(fēng)險(xiǎn)的可能性較高；RQ≥0.5，急性高風(fēng)險(xiǎn)[21]。將經(jīng)由GENEEC 2.0模擬的EEC和以實(shí)測(cè)濃度推算的48 h-LC50帶入RQ計(jì)算公式，求得毒死蜱相對(duì)于大型溞、低額溞、裸腹溞、劍水蚤、介形蟲(chóng)、花翅搖蚊幼蟲(chóng)的急性RQ。它們分別為10.29、52.95、27.20、0.73、1.96、0.06。可見(jiàn)除了花翅搖蚊，在稻田中按照推薦劑量施用的毒死蜱對(duì)于棲息于田邊池塘中的水生節(jié)肢動(dòng)物均具有較高的急性風(fēng)險(xiǎn)[17]。

以上結(jié)果說(shuō)明：毒死蜱對(duì)于劍水蚤等5種甲殼綱浮游動(dòng)物均具有較高程度的急性風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步加強(qiáng)管理。

表3 以GENEEC預(yù)測(cè)農(nóng)田附近池塘水中毒死蜱濃度Table 3 Estimation of concentration of chlorpyrifos in pond water adjacent to field under the help of GENEEC

注:a均來(lái)自農(nóng)業(yè)部“農(nóng)藥電子查詢服務(wù)系統(tǒng)"；b均來(lái)自英國(guó)"University of Hertfordshire"的"Pesticide Properties DataBase"； ai為有效成分，ha為公頃。

Note: a: are from the Ministry of Agriculture "Pesticide electronic inquiry service system"; b: are from the UK "University of Hertfordshire" and "Pesticide Properties DataBase"; ai is the active ingredient, ha is hectare.

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