蘇紅巧，付旭鋒，趙亞嫻，樓欽欽，秦占芬

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物和人體生長(zhǎng)發(fā)育的影響廣受關(guān)注[1]。1991年美國(guó)材料與測(cè)試協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials, ASTM)頒布檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)發(fā)育毒性的《非洲爪蟾胚胎致畸試驗(yàn)(Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus, FETAX)導(dǎo)則》，經(jīng)過(guò)多次修訂，該方法已用于化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境樣品發(fā)育毒性的測(cè)試[2]。ASTM對(duì)FETAX試驗(yàn)進(jìn)行解釋?zhuān)罕M管該方法是以非洲爪蟾為試驗(yàn)生物建立的，但是各地可以根據(jù)當(dāng)?shù)毓芾砘蚱渌矫娴男枰?，選擇當(dāng)?shù)氐耐芸苹蝮蛤芸苿?dòng)物種作為試驗(yàn)生物開(kāi)展試驗(yàn)，但試驗(yàn)方法需要根據(jù)具體種屬的胚胎生物學(xué)特性做些調(diào)整。

黑斑蛙是我國(guó)最為常見(jiàn)的一個(gè)蛙種，屬蛙科蛙屬，幾乎分布于全國(guó)各地。多年來(lái)被用作生物學(xué)研究和教學(xué)的實(shí)驗(yàn)材料[3]。近年來(lái)，黑斑蛙逐漸被用作環(huán)境污染檢測(cè)和生態(tài)毒理學(xué)的試驗(yàn)生物。應(yīng)浩等[4]用黑斑蛙胚胎檢測(cè)了河南新鄉(xiāng)段衛(wèi)河水的污染情況。汪學(xué)英等[5]和盧祥云等[6]分別研究了重金屬和農(nóng)藥對(duì)黑斑蛙胚胎的毒性作用。任東凱等[7]研究了新型污染物全氟辛烷磺酸鹽及其替代品對(duì)黑斑蛙胚胎的發(fā)育毒性。這些研究為化學(xué)品管理、農(nóng)藥的合理使用及兩棲動(dòng)物保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。但是這些現(xiàn)有研究報(bào)道中，對(duì)胚胎階段、暴露溫度等試驗(yàn)條件的選擇比較混亂，這大大降低了實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的可比較性。另外，所用到的試驗(yàn)生物-黑斑蛙胚胎大多來(lái)自于野外采集，受自然界黑斑蛙產(chǎn)卵季節(jié)的限制。采集到的試驗(yàn)材料也存在污染背景不明、遺傳背景不清等諸多問(wèn)題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定性增加、重現(xiàn)性降低等。20世紀(jì)80年代初，OECD等國(guó)際組織在對(duì)一些測(cè)試方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的同時(shí)，十分注重供試生物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化工作[8]。近三年來(lái)，我們實(shí)驗(yàn)室將野生黑斑蛙引入實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)展了較為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化及相關(guān)的生物學(xué)研究，目前黑斑蛙已具備作為試驗(yàn)生物的條件，可用于化學(xué)品的毒性測(cè)試[9]。

鑒于此，本文擬參照FETAX試驗(yàn)方法，使用實(shí)驗(yàn)室孵育的黑斑蛙胚胎為試驗(yàn)材料，確定黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)方法的條件：選擇五氯酚、視磺酸、氯化鎘、重鉻酸鉀四種典型的具有胚胎毒性的化學(xué)物質(zhì)為測(cè)試物，研究黑斑蛙胚胎對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感性；選擇五氯酚為測(cè)試物，研究黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)的重復(fù)性。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：兩棲動(dòng)物誘導(dǎo)繁育設(shè)備(本實(shí)驗(yàn)室研發(fā))；體式顯微鏡(XTL0745，重慶光電儀器有限公司)；脫色搖床(TS-1，江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；90 mm和150 mm玻璃培養(yǎng)皿(北京玻璃集團(tuán)臺(tái)州博美玻璃儀器廠)；巴斯德吸管(海門(mén)市如意橡塑制品廠)。

試劑：五氯酚(CAS NO. 87-86-5, Dr.Ehrenstorfer)；視磺酸(97%, CAS NO. 302-79-4, J&K)；氯化鎘、重鉻酸鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；促黃體素釋放激素(LHRH, Sigma)；人絨毛膜促性腺激素(HCG, 煙臺(tái)北方制藥有限公司); 半胱氨酸(北京索萊寶科技有限公司); MS-222 (Sigma)。

1.2 試驗(yàn)生物

本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的成年黑斑蛙，飼養(yǎng)在水陸兩棲的玻璃缸中，每日喂食面包蟲(chóng)一次，清洗玻璃缸。水溫24±1℃，明暗光周期為12 h:12 h。

成年雌蛙皮下注射20 μg LHRH和300 IU HCG，成年雄蛙皮下注射20 μg LHRH和200 IU HCG，放入兩棲動(dòng)物誘導(dǎo)繁育設(shè)備中，置于黑暗陰涼處，誘導(dǎo)其抱對(duì)產(chǎn)卵。

用10 cm×20 cm整理盒收集受精卵，2%(W/V)的半胱氨酸(pH 7.8～8.0), 在脫色搖床上進(jìn)行脫膜。脫膜過(guò)程分兩次，第一次持續(xù)15～20 min，至卵團(tuán)分離成單個(gè)的受精卵。用去氯自來(lái)水沖洗3次后加入2%半胱氨酸進(jìn)行第二次脫膜，大約持續(xù)10～15 min，至受精卵外層膜脫落后，用去氯自來(lái)水漂洗5次以上，倒入150 mm培養(yǎng)皿中。

體式顯微鏡下觀察胚胎，選擇發(fā)育正常的Gosner 8期(中囊胚期)至Gosner 10(原腸胚早期)的胚胎[10]進(jìn)行暴露試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 限度試驗(yàn)和預(yù)試驗(yàn)

受試化學(xué)品的最大水溶解度大于或等于100 mg·L-1時(shí)，以100 mg·L-1濃度進(jìn)行限度試驗(yàn)；受試化學(xué)品的最大水溶解度小于100 mg·L-1時(shí)，則在最大溶解度下進(jìn)行限度試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，如果使用助溶劑則需要增設(shè)溶劑對(duì)照組，其中溶劑的濃度與限度濃度處理組中溶劑濃度相同。助溶劑的體積濃度不得超過(guò)0.1‰。限度濃度下96 h暴露，胚胎沒(méi)有出現(xiàn)死亡和畸形，則不再進(jìn)行下一步試驗(yàn)，認(rèn)為該受試化學(xué)品的96 h半數(shù)致死濃度(median lethal concentration, LC50)和96 h半數(shù)致畸濃度(median teratogenic concentration, TC50)大于限度濃度。

預(yù)試驗(yàn)設(shè)置間距較大的4～5個(gè)濃度組配制試驗(yàn)溶液，按幾何級(jí)數(shù)間距選擇濃度，確定胚胎96 h最低全致死濃度和最高全存活濃度，作為正式試驗(yàn)的上下限濃度。如果數(shù)據(jù)不充分，無(wú)法確定正式試驗(yàn)所需要的濃度范圍，則重新選擇一個(gè)濃度范圍進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

1.3.2 正式試驗(yàn)

通過(guò)一次或兩次預(yù)試驗(yàn)，確定合適的濃度范圍，以一定級(jí)差間距設(shè)置5～7個(gè)濃度組，濃度間隔系數(shù)應(yīng)小于或等于2.2。四種受試化合物暴露胚胎的正式試驗(yàn)濃度范圍分別為五氯酚：71.0～810.0 μg·L-1；視磺酸：4.5～76.9 μg·L-1；氯化鎘：2.0～8.6 mg·L-1；重鉻酸鉀：29.6～225 mg·L-1。同樣，設(shè)空白對(duì)照組，如果使用助溶劑則需要增設(shè)溶劑對(duì)照組，其中溶劑的濃度與最高濃度處理組溶劑濃度相同。溶劑的體積濃度不超過(guò)0.1‰。每個(gè)處理組設(shè)置2個(gè)平行。

暴露試驗(yàn)在90 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每個(gè)培養(yǎng)皿加入40 mL暴露液，用巴斯德吸管隨機(jī)放入黑斑蛙胚胎25只。置于恒溫培養(yǎng)箱中，暴露溫度為25±1 ℃，明暗光周期為12 h:12 h。為避免視磺酸分解，視磺酸暴露層用黑色袋子遮蓋。每隔24 h換液，清除死亡個(gè)體，記錄死亡數(shù)。暴露結(jié)束時(shí)，記錄每個(gè)培養(yǎng)皿胚胎死亡數(shù)和畸形的數(shù)目(存活胚胎)。存活胚胎用100 mg·L-1的MS-222處理后，再用10%的福爾馬林固定，立即測(cè)量頭-尾長(zhǎng)度。如果胚胎呈弧形，則沿著胚胎的外形進(jìn)行測(cè)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

詳細(xì)登記每個(gè)培養(yǎng)皿中胚胎的死亡、畸形和生長(zhǎng)情況。以受試化學(xué)品濃度的對(duì)數(shù)值為自變量(x)，以相應(yīng)濃度下胚胎死亡/畸形的幾率值為因變量(y)，采用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理軟件，使用Probit進(jìn)行回歸分析，計(jì)算LC50值、TC50值及其95%置信限，計(jì)算致畸指數(shù)(teratogenic index, TI)值(TI = 96 h-LC50/96 h-TC50)。如所得數(shù)據(jù)不適合計(jì)算TC50，則記錄受試濃度下的胚胎畸形數(shù)。胚胎體長(zhǎng)數(shù)據(jù)在p=0.05水平，用T-檢驗(yàn)確定最小抑制生長(zhǎng)濃度 (minimum concentration to inhibit growth, MCIG)。

如果試驗(yàn)數(shù)據(jù)不適于用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算LC50和TC50，可用不引起死亡/畸形的最高濃度和引起100%死亡/畸形的最低死亡濃度的幾何平均值估算LC50、TC50。

變異系數(shù)= (標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值MN)×100%

2 結(jié)果(Results)

2.1 四種受試化合物的胚胎發(fā)育毒性

四種受試化合物對(duì)黑斑蛙胚胎的半數(shù)致死濃度LC50、半數(shù)致畸濃度TC50、致畸指數(shù)(TI) 及最小抑制生長(zhǎng)濃度(MCIG) 如表1所示。五氯酚、視磺酸、氯化鎘和重鉻酸鉀對(duì)黑斑蛙胚胎的LC50分別為572.3 μg·L-1、54.8 μg·L-1、6.8 mg·L-1和97.5 mg·L-1。五氯酚、視磺酸和氯化鎘對(duì)黑斑蛙胚胎的TC50分別為246.5 μg·L-1、18.7 μg·L-1和3.4 mg·L-1，TI分別為2.3、2.9和2.0，MCIG分別為160.0 μg·L-1、10.1 μg·L-1和2.4 mg·L-1。重鉻酸鉀也導(dǎo)致黑斑蛙胚胎發(fā)育畸形，但在暴露結(jié)束之前已經(jīng)死亡，故未計(jì)算出TC50。

各濃度五氯酚暴露黑斑蛙胚胎24 h后導(dǎo)致明顯的畸形，如圖1所示：圖中a為對(duì)照組胚胎，b、c、d分別是160、800、4 000 μg·L-1五氯酚暴露組胚胎。與對(duì)照組胚胎相比，160、800、4 000 μg·L-1暴露組對(duì)胚胎的生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象，且隨著暴露濃度升高，抑制作用明顯，證明五氯酚具有抑制黑斑蛙胚胎生長(zhǎng)的作用。

黑斑蛙胚胎暴露視磺酸試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生的各種畸形如圖2所示。從圖中可以看出，視磺酸導(dǎo)致胚胎全身各部位的畸形現(xiàn)象。

表1 四種受試化合物對(duì)黑斑蛙胚胎的LC50、TC50、TI 和 MCIGTable 1 LC50, TC50, TI and MCIG values of four test substances for Pelophylax nigromaculatus embryos.

注：*方括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)為該終點(diǎn)指標(biāo)的95%置信區(qū)間。

Note: *Data in the square brackets indicate the 95% confidence interval of the corresponding endpoint.

圖1 五氯酚暴露24 h的黑斑蛙胚胎(a: 對(duì)照組，b-d: 處理組)Fig. 1 Pelophylax nigromaculatus embryos exposed to pentachlorophenol for 24 h

圖2 視磺酸暴露的黑斑蛙胚胎(a: 對(duì)照組，b-f: 處理組)Fig. 2 Pelophylax nigromaculatus embryos exposed to retinoic acid

除了上述的致死、致畸及抑制生長(zhǎng)的作用外，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)暴露氯化鎘、五氯酚和視磺酸引起黑斑蛙胚胎運(yùn)動(dòng)行為異常，主要表現(xiàn)在高濃度暴露組胚胎游動(dòng)遲緩、對(duì)外界刺激無(wú)反應(yīng)等。

2.2 黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)方法的重復(fù)性

選取五氯酚分別暴露來(lái)自3對(duì)不同成蛙的黑斑蛙胚胎，研究黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)方法的重復(fù)性，結(jié)果如表2所示：發(fā)育毒性終點(diǎn)指標(biāo)LC50、TC50、TI及MCIG的變異系數(shù)分別為12.6%、18.0%、23.0%和18.6%。

表2 三次重復(fù)試驗(yàn)中五氯酚對(duì)黑斑蛙胚胎的LC50、TC50、TI 、MCIG及相應(yīng)的變異系數(shù)Table 2 LC50, TC50, TI and MCIG values and their variable coefficients of pentachlorophenol for Pelophylax nigromaculatus embryos in three repeat tests.

注：LC50、TC50及MCIG的單位均為μg·L-1。

Note: Units of LC50、TC50and MCIG are μg·L-1.

3 討論(Discussion)

化學(xué)品的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，根據(jù)需求選擇適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)動(dòng)物尤為重要。兩棲動(dòng)物進(jìn)行體外受精，產(chǎn)卵量大，胚胎發(fā)育肉眼可見(jiàn)，是良好的胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)的生物模型。非洲爪蟾胚胎致畸試驗(yàn)(FETAX)可以簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)化學(xué)品的發(fā)育毒性，現(xiàn)已廣泛的用于單一化學(xué)品、環(huán)境樣品發(fā)育毒性的檢測(cè)中[11-12]。但是生態(tài)系統(tǒng)的敏感種和優(yōu)勢(shì)種具有地域差異，使用本土生物種代替國(guó)際通用種用于各國(guó)的化學(xué)品毒性評(píng)價(jià)是目前的環(huán)境管理的趨勢(shì)和要求[13-14]。2010年我國(guó)環(huán)境保護(hù)部頒布《新化學(xué)物質(zhì)環(huán)境管理辦法》[15]，明確要求新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)時(shí)，所提供的生態(tài)毒理學(xué)特性測(cè)試報(bào)告中必須包括用我國(guó)本土生物種獲得的毒性數(shù)據(jù)。因此，本文選擇我國(guó)的本土兩棲動(dòng)物種黑斑蛙為試驗(yàn)生物，參考FETAX方法建立一種評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)胚胎發(fā)育毒性的方法。

3.1 黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)方法條件的選擇

近年來(lái)，很多研究者選擇黑斑蛙胚胎進(jìn)行環(huán)境污染檢測(cè)和生態(tài)毒理學(xué)的研究。但是由于實(shí)驗(yàn)條件的不一致導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)缺乏可比較性。在胚胎發(fā)育階段的描述方面，有參照Gosner分階段法的[4,7]，也有參照王應(yīng)天[16-17]、朱冶平[6,18]分階段法的。其中Gosner分階段法是國(guó)際通用的方法，趙爾宓[19]對(duì)此方法有過(guò)詳細(xì)介紹。在黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性研究中，建議采用Gosner的分階段法。對(duì)于胚胎暴露的起始階段，有的文章未指明[5,20]，有的則暴露幾個(gè)不同的發(fā)育階段[16-17]。參照FETAX方法標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該以囊胚中期至原腸胚早期胚胎開(kāi)始暴露，至胚胎發(fā)育完成階段結(jié)束。因?yàn)槟遗咧衅谥氨┞?，可能?dǎo)致胚胎卵裂異常，而原腸胚早期之后的胚胎已經(jīng)開(kāi)始了器官發(fā)育。胚胎暴露的溫度，20～26 ℃的都有研究者選用。黑斑蛙胚胎的發(fā)育會(huì)受到溫度和密度變化的影響，本文選擇胚胎暴露溫度為25±1 ℃，90 mm培養(yǎng)皿，40 mL培養(yǎng)液，保證在96 h時(shí)完成整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程到達(dá)Gosner 25階段。如果實(shí)驗(yàn)條件無(wú)法滿(mǎn)足此要求，則需要根據(jù)胚胎發(fā)育階段決定實(shí)驗(yàn)的起始與終止。

3.2 黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)指標(biāo)的選擇

對(duì)于胚胎發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)，國(guó)內(nèi)研究主要是以半數(shù)致死濃度和半數(shù)致畸濃度為評(píng)價(jià)終點(diǎn)。致畸指數(shù)(TI)則可用于評(píng)價(jià)化學(xué)品的潛在致畸毒性，當(dāng)TI值≥2時(shí)，表示該化學(xué)品具有較大的致畸性[21]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，五氯酚、視磺酸、氯化鎘的致畸指數(shù)分別為2.3、2.9和2.0，表明這三種物質(zhì)對(duì)黑斑蛙胚胎的致畸作用明顯。化學(xué)品對(duì)胚胎的生長(zhǎng)抑制作用是發(fā)育毒性的一個(gè)重要方面，所以最小抑制生長(zhǎng)濃度(MCIG)也是一個(gè)重要指標(biāo)。MCIG是指暴露結(jié)束后，測(cè)量各濃度暴露組胚胎頭-尾長(zhǎng)度，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，得出受試化學(xué)品抑制胚胎生長(zhǎng)的最低濃度。本文研究顯示，五氯酚、視磺酸和氯化鎘的MCIG分別為160.0 μg·L-1、10.1 μg·L-1和2.4 mg·L-1。

半數(shù)致畸濃度TC50只是對(duì)于導(dǎo)致畸形的測(cè)試物有效，如本文中檢測(cè)的重鉻酸鉀，在試驗(yàn)暴露結(jié)束時(shí)，存活胚胎并無(wú)明顯的畸形，從而未能計(jì)算TC50和TI兩個(gè)指標(biāo)。對(duì)于胚胎畸形的辨別，不同的試驗(yàn)人員可能會(huì)做出不同的判斷。因此，為了增加實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，應(yīng)在以后的研究中積累黑斑蛙胚胎畸形的數(shù)據(jù)，繪制黑斑蛙胚胎畸形圖譜。

此外，化學(xué)品可能會(huì)對(duì)兩棲動(dòng)物胚胎的運(yùn)動(dòng)行為產(chǎn)生影響。本文選擇的氯化鎘、五氯酚和視磺酸暴露導(dǎo)致胚胎游動(dòng)緩慢，所以胚胎的游動(dòng)行為也可以作為胚胎發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，這有待以后更多的探索?？傊诎咄芘咛グl(fā)育試驗(yàn)從半數(shù)致死濃度LC50、半數(shù)致畸濃度TC50、致畸指數(shù)TI及最小抑制生長(zhǎng)濃度MCIG等幾個(gè)終點(diǎn)指標(biāo)，可以很好地評(píng)價(jià)化學(xué)品的發(fā)育毒性。同時(shí)，以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，還可以開(kāi)發(fā)更多的終點(diǎn)指標(biāo)，以更好地進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。

3.3 黑斑蛙胚胎對(duì)胚胎毒物的敏感性

視磺酸是一種生物內(nèi)源信號(hào)分子，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用，但是過(guò)量的視磺酸會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形[22-23]，被認(rèn)為是一種典型的致畸劑。五氯酚是一種高效價(jià)廉的除草劑、殺蟲(chóng)劑和消毒劑。研究顯示，五氯酚能引起非洲爪蟾、魚(yú)類(lèi)、鼠類(lèi)胚胎發(fā)育畸形[24-26]。重金屬離子是環(huán)境中主要的污染物之一，具有很強(qiáng)的生物毒性作用[27-28]。鎘(Cd)和鉻(Cr)是兩種常見(jiàn)的重金屬，二者的胚胎發(fā)育毒性已有諸多研究[29-30]。本文研究結(jié)果顯示，這四種化學(xué)物質(zhì)對(duì)黑斑蛙胚胎均具有明顯的發(fā)育毒性。

收集文獻(xiàn)中這四種化學(xué)物質(zhì)對(duì)非洲爪蟾胚胎發(fā)育毒性的數(shù)據(jù)(表3)，與本文中對(duì)黑斑蛙胚胎毒性的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)：對(duì)于五氯酚，比較其致畸指數(shù)TI，非洲爪蟾胚胎更敏感些，而從最小抑制生長(zhǎng)濃度MCIG看，兩類(lèi)胚胎的敏感性相當(dāng)；比較氯化鎘和重鉻酸鉀對(duì)兩類(lèi)胚胎的LC50和TC50，發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)胚胎對(duì)這兩種化學(xué)品的致死敏感性相當(dāng)，致畸敏感性則非洲爪蟾胚胎比較強(qiáng)；而視磺酸對(duì)非洲爪蟾胚胎的LC50、TC50和MCIG都明顯高于對(duì)黑斑蛙的相應(yīng)指標(biāo)，顯示黑斑蛙對(duì)視磺酸胚胎的致死、致畸作用和生長(zhǎng)抑制作用更敏感。鑒于上述黑斑蛙胚胎和非洲爪蟾胚胎對(duì)不同化學(xué)品敏感性的差異，在我國(guó)化學(xué)品管理中，選擇本土黑斑蛙胚胎進(jìn)行發(fā)育毒性評(píng)價(jià)更為合理。

表3 四種受試化合物對(duì)非洲爪蟾胚胎的LC50、TC50、TI 和 MCIGTable 3 LC50, TC50, TI and MCIG values of four test substances for Xenopuslaevis embryos

3.4 黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)方法的重復(fù)性

不同的生物體存在個(gè)體差異，所以不同親代蛙的子代質(zhì)量往往會(huì)有差異，從而對(duì)化學(xué)物質(zhì)毒性的敏感性也有所不同。Bantle等對(duì)FETAX試驗(yàn)的重復(fù)性進(jìn)行了研究[33]，發(fā)現(xiàn)剔除離群值后，LC50的變異系數(shù)范圍為1.8%～40.8%；TC50的變異系數(shù)范圍為3.5%～31.6%；TI的變異系數(shù)范圍為1.3%～54.1%；MCIG的變異系數(shù)范圍為0%～119.7%。本文以五氯酚為測(cè)試物，進(jìn)行的黑斑蛙發(fā)育毒性重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，終點(diǎn)指標(biāo)LC50、TC50、TI及MCIG的變異系數(shù)分別為12.6%、18.0%、23.0%和18.6%，這些值落在FETAX試驗(yàn)變異系數(shù)范圍之內(nèi)，顯示黑斑蛙胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)的重復(fù)性與FETAX相當(dāng)，可以用于化學(xué)品的毒性測(cè)試。

總之，本文參考FETAX試驗(yàn)方法，建立了一種以本土黑斑蛙胚胎為試驗(yàn)材料的評(píng)價(jià)化學(xué)品胚胎發(fā)育毒性的方法，與FETAX比較具有相當(dāng)?shù)幕虿町惖拿舾行?，同時(shí)與FETAX試驗(yàn)的重復(fù)性相當(dāng)。顯示該方法可用于我國(guó)化學(xué)品的毒性評(píng)價(jià)，為我國(guó)的化學(xué)品管理提供技術(shù)支持。

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