杜俊俏，廖承紅，周海龍，刁曉平2,,*，陳好，李玉虎，王富強(qiáng)

1. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228 3. 海南大學(xué)?？谑协h(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228 2. 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228 4. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228

近年來(lái),持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)對(duì)海洋環(huán)境的影響成為近海環(huán)境保護(hù)面臨的重要問(wèn)題之一，基于污染物的特性，生物監(jiān)測(cè)成為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中必不可少的工具。隨著研究的深入，分子研究水平更能靈敏的檢測(cè)生物體對(duì)污染物的反應(yīng)機(jī)制，因此，研究和建立敏感的分子生物標(biāo)志物，顯得十分必要。

多環(huán)芳烴作為一種持久性有機(jī)污染物廣泛分布在環(huán)境介質(zhì)中，其中有很多是已知的或是潛在的致癌物質(zhì)。1979年美國(guó)環(huán)保署USEPA已將16種PAHs列入優(yōu)先控制的有機(jī)污染物黑名單[1]。芘作為多環(huán)芳烴的一種典型4環(huán)物質(zhì)，具有遺傳毒性和致癌性[2]?；诮AHs的污染特點(diǎn)以及毒性效應(yīng)特征，對(duì)PAHs的環(huán)境污染狀況開(kāi)展生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究體現(xiàn)出重要的意義。熱休克蛋白(heat shock protein，HSPs)是一類(lèi)保守的應(yīng)激蛋白，已被廣泛用作于生物標(biāo)志物，以反應(yīng)環(huán)境應(yīng)激和毒性[3]。在熱休克蛋白家族中，研究較為廣的是hsp70和hsp90家族基因。HSP90在保護(hù)生物體中起著重要的作用，它能被一系列的壓力因素所調(diào)控，如熱或冷應(yīng)激，高滲應(yīng)激，餌料匱乏，低含氧量，多氯聯(lián)苯(PCB)，砷和重金屬等，并且能用來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境有毒物質(zhì)和環(huán)境應(yīng)激[4-9]。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白對(duì)蝦(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺組織hsp90的表達(dá)量在pH和氨態(tài)氮的應(yīng)激下發(fā)生不同的變化；Snyder等[11]研究發(fā)現(xiàn)在貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和鮑魚(yú)(Haliotisrufescens)組織中，hsp70、hsp60、hsp90基因?qū)岽碳ず徒到馐偷拇碳ざ甲龀隽瞬煌母袘?yīng)。劉娜[12]研究了苯并芘暴露對(duì)菲律賓蛤仔hsp90基因的影響，結(jié)果表明在染毒第10天，Hsp90基因的表達(dá)量顯著誘導(dǎo)上升。

目前，從雙殼貝類(lèi)克隆得到的hsp90包括櫛孔扇貝(C.farreri)、菲律賓蛤仔(V.philippinarum)、紋冠蚌(C.plicata)、太平洋牡蠣(C.gigas)等。而關(guān)于多環(huán)芳烴芘對(duì)熱帶海洋重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物馬氏珠母貝hsp90的表達(dá)影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用RACE技術(shù)擴(kuò)增馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長(zhǎng)，對(duì)不同組織中hsp90的表達(dá)進(jìn)行半定量和定量分析，同時(shí)利用熒光定量PCR方法檢測(cè)芘暴露對(duì)馬氏珠母貝肝胰腺組織hsp90基因表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討hsp90作為分子生物標(biāo)記物監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境多環(huán)芳烴污染狀況的可能性，為建立海洋環(huán)境污染的生態(tài)效應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

主要實(shí)驗(yàn)試劑芘純度99%(Aladdin公司)；TRIzoL Reagent (invitrogen公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒以及RACE試劑盒，熒光染料試劑盒等均購(gòu)自大連Takara公司，其他等試劑購(gòu)于海南天地科技有限公司；其余試劑均為市售分析純藥品。主要儀器為My Cycler thermal cycler(Bio-Rad，USA)，Nano drop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，USA)；ABI7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)購(gòu)于海南省陵水市養(yǎng)殖場(chǎng)，貝齡1.5齡，殼高5.78±0.26 cm，暫養(yǎng)于曝氣海水中，連續(xù)充氣，水溫25±1 ℃，pH 8.2，鹽度30‰?；铙w取其鰓組織立即投入液氮中，并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

總RNA提取時(shí)，取50～100 mg保存于-80 ℃鰓組織于研缽上，按照TRIzoL試劑說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA，得到的總RNA沉淀用DEPC處理過(guò)的無(wú)RNase的水溶解分裝保存于-80 ℃。RNA的完整性通過(guò)普通1%瓊脂糖電泳，EB染色，觀察。RNA的濃度OD值采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，取A260/280=1.8～2.0的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取1 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)的要求反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA于-20 ℃保存。

1.4 hsp90基因部分片段的克隆

根據(jù)NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的紋冠蚌(C.plicata)(HQ180224.1)、菲律賓蛤仔(V.philippinarum)(HM581640.1)、太平洋牡蠣(C.gigas)(EF687776.1)、櫛孔扇貝(C.farreri) (AY362761.1)等近緣物種序列，使用Primer Premier 5.0和Oligo 7.0，Mega 5.0等軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物(見(jiàn)表1)。在0.2 mL EP管中加入10×Taq buffer 5 μL，2.5 mM dNTP 4 μL，hsp90-F/hsp90-R(10 μM)各2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，cDNA模板2 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；采用Touchdown PCR，5個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，62～54 ℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)降2 ℃)，72 ℃ 45 s；29個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)確定目的片段后，切下目的條帶稱(chēng)重，按照Agarose Gel DNA purification Kit 說(shuō)明書(shū)純化 PCR 產(chǎn)物。將純化后的DNA片段與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α表達(dá)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功，將成功轉(zhuǎn)化的菌液送去上海生工測(cè)序。

1.5 hsp90cDNA末端快速擴(kuò)增反應(yīng)(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)

為了得到hsp90cDNA全長(zhǎng)，根據(jù)1.4所得基因片段序列分別設(shè)計(jì)5’和3’RACE特異性引物。

5’RACE：cDNA采用SMARTer II A primer and 5’CDS primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后取2 μL作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，50 μL反應(yīng)體系中加入1 μL 3’特異性引物hsp90_GSP1(10 μM)與1 μL 5’接頭引物ΜPA primer，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循環(huán)，72 ℃ 0 min。所得到的的PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋?zhuān)? μL模板作為巢式PCR反應(yīng)模板，取1 μL 3’特異性巢式引物hsp90_NGSP1(10 μmol·L-1)與5 μL通用引物NΜP(10×)進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循環(huán)，72 ℃ 10 min。

3’RACE：cDNA采用3’CDS primer A進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得到的的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)100倍稀釋后取2 μL作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以5’特異性引物hsp90_GSP2、hsp90_NGSP2分別搭配3’末端通用接頭引物ΜPA primer、NΜP進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件與5’RACE相同。

1.6 hsp90cDNA序列分析和拼接

將所得到的的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行割膠回收，連接轉(zhuǎn)化等方法同上。將菌液送上海生工進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用NCBI Blast在線程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。將序列進(jìn)行拼接比對(duì)，并對(duì)所得到的序列以及所對(duì)應(yīng)的蛋白序列的保守區(qū)域進(jìn)行分析。

1.7 hsp90在不同組織中的表達(dá)

采集肝胰腺、鰓、外套膜以及閉殼肌、性腺、腹足等組織，分別提取總RNA，采用半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)hsp90在不同組織中的表達(dá)量的情況。

1.8 染毒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以自然海區(qū)所測(cè)芘的含量以及預(yù)實(shí)驗(yàn)的處理為參照依據(jù)，設(shè)置染毒濃度組。用一定量丙酮(助溶劑)溶解芘，配成一定濃度的儲(chǔ)備液，設(shè)置5個(gè)芘處理組(0、4、8、16、32 μg·L-1)進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，以0濃度為對(duì)照組，所有實(shí)驗(yàn)處理組均設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在50 cm×40 cm×30 cm的塑料水槽中進(jìn)行，每只水槽20 L水，放18只大小均勻的馬氏珠母貝，實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)通氣，不投餌料，每天換水100%并保證實(shí)驗(yàn)濃度前后一致。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后分別于染毒1 d、5 d、7 d取樣。取樣時(shí)，每個(gè)平行組隨機(jī)取貝3只，取其肝胰腺組織，立即投入液氮中，之后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.9 芘對(duì)馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因表達(dá)水平影響的定量檢測(cè)

各個(gè)濃度與時(shí)間的肝胰腺組織樣，RNA提取方式與1.4相同，反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格參照One Step SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，產(chǎn)物于-20 ℃保存待測(cè)。用于熒光定量PCR的引物如表1。Qhsp90根據(jù)已獲得的cDNA片段(Genbank登錄號(hào)KJ010545)設(shè)計(jì)熒光定量引物目的片段大小149 bp，內(nèi)參引物gapdh根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)(Genbank登錄號(hào)AB205404.1)，目的片段大小134 bp。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR green 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ROX dye II 0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)：94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；溶解曲線條件：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，94 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s。

1.10 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR所得的數(shù)據(jù)應(yīng)用Delta-Delta Ct方法[13]進(jìn)行相對(duì)定量分析，基因的相對(duì)表達(dá)水平所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel和SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 馬氏珠母貝hsp90基因cDNA克隆與序列比對(duì)分析

利用簡(jiǎn)并引物，從馬氏珠母貝鰓組織中擴(kuò)得了cDNA為743 bp大小的hsp90目的基因部分片段。通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)從馬氏珠母貝鰓組織中成功克隆了總長(zhǎng)度為2 584 bp的hsp90 cDNA全長(zhǎng)序列。其中5’末端非編碼區(qū)(untranslation region, UTR)為75 bp，開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)包含2 178 bp，編碼725 aa，分子質(zhì)量為83.76 KDa，3’末端非編碼區(qū)(Untranslation region, UTR)為332 bp。通過(guò)在線BLAST比對(duì)結(jié)果說(shuō)明，由馬氏珠母貝hsp90基因cDNA序列推導(dǎo)得到的氨基酸序列與其他親緣物種具有高度同源性，且具有5個(gè)hsp90家族保守區(qū)域以及C端共有氨基酸序列MEEVD(如圖1陰影部分)，由此確認(rèn)所得序列為馬氏珠母貝hsp90基因的cDNA全長(zhǎng)。

應(yīng)用ClustalW以及MEGA5.0軟件將馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)HSP90氨基酸序列與GenBank中其他多種生物的HSP90氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并利用DNAMAN軟件繪制進(jìn)化樹(shù)(如圖2)。馬氏珠母貝HSP90與不同物種的進(jìn)化樹(shù)分析顯示，HSP90與雙殼類(lèi)(櫛孔扇貝AAR11781.1、菲律賓蛤仔ADK11101.1、海灣扇貝ABS50431.1、太平洋牡蠣ABS18268.1和近江牡蠣ADL59936.1)匯聚為一個(gè)分支，而其它物種如家鼠(NP_034610.1)、斑馬魚(yú)(AAC21566.1)、虹鱒魚(yú)(NP_001118063.1)和中華蟾蜍(ABD75383.1)等則聚為另一分支。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長(zhǎng)及氨基酸序列注：陰影部分為熱休克蛋白90家族的特征序列；起始密碼和終止密碼子用下劃線指出Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of hsp90 from Pinctada martensiiNote: Heat shock protein 90 family signature motifs were highlighted as shaded regions; the start codon and stop codon were underlined.

圖2 不同物種HSP90進(jìn)化樹(shù)分析(Bootstrap值為1 000，每個(gè)分支數(shù)值為Bootstrap分析所得百分比)進(jìn)化樹(shù)中的不同物種HSP90s: C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of protein sequences from Pinctada martensii and other selected species( Aligned sequences were bootstrapped 1 000 times and the numbers at the forks indicate the bootstrap proportions) ：C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).

2.2 馬氏珠母貝中hsp90基因組織特異性分析

采用半定量和熒光定量PCR檢測(cè)hsp90基因在馬氏珠母貝外套膜(mantle)、鰓(gill)、肝胰腺(hepatopancreas)、閉殼肌(adductor muscle)、性腺(gonad)以及腹足(pleopod)中的表達(dá)情況。如圖3所示，hsp90基因在不同組織中的表達(dá)順序?yàn)椋盒韵?鰓>肝胰腺>外套膜>腹足>閉殼肌。

2.3 芘暴露對(duì)hsp90基因表達(dá)水平的影響

本研究用芘對(duì)馬氏珠母貝進(jìn)行暴露處理實(shí)驗(yàn)，設(shè)置5個(gè)不同的處理濃度組(0、4、8、16、32 μg·L-1)，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)芘處理后第1天、5天、7天馬氏珠母貝肝胰腺組織hsp90基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。圖4-A結(jié)果表明，在肝胰腺組織中，染毒后第1 天，低濃度組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，但較高濃度組(16、32 μg·L-1)hsp90基因的表達(dá)量相比對(duì)照組顯著上調(diào)(p<0.05)。染毒后第5天，與相同時(shí)間對(duì)照組比較，誘導(dǎo)現(xiàn)象明顯，高濃度組32 μg·L-1表達(dá)量顯著上調(diào)(p<0.05)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，染毒后第7天，各濃度組hsp90基因表達(dá)量逐漸恢復(fù)到正常水平。從圖4-B中發(fā)現(xiàn)，在芘處理后第1天和第5天，hsp90基因的相對(duì)表達(dá)水平隨著濃度的升高表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 hsp90基因在不同組織中半定量和熒光定量PCR的結(jié)果(M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)Fig. 3 hsp90 expression level in different tissues by RT-PCR and real-time PCR (M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)

圖4 馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因相對(duì)表達(dá)水平隨芘暴露處理時(shí)間變化情況(A)和馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因相對(duì)表達(dá)水平隨芘暴露處理濃度變化情況(B) (*：與對(duì)照組比較，p<0.05)Fig. 4 Changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with Pyrene treatment time (A) and changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with pyrene treatment concentration (B) in hepatopancreas (*: compared with the control group, p<0.05)

3 討論(Discussion)

熱休克蛋白(HSPs)是普遍存在的且高度保守的應(yīng)激蛋白，出現(xiàn)在從細(xì)菌到人類(lèi)的所有生物中。當(dāng)生物體處于潛在的有害條件時(shí)，它們扮演著重要的角色[14-16]。本研究通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的hsp90基因，其編碼的氨基酸序列與其他近緣物種Blast比對(duì)結(jié)果可判定擴(kuò)增所得到的cDNA序列屬于hsp90基因家族，根據(jù)它的C-末端MEEVD序列的存在[17]，推定HSP90屬于胞質(zhì)HSP90家族。馬氏珠母貝HSP90與其他雙殼貝類(lèi)(如香港巨牡蠣、櫛孔扇貝)、魚(yú)類(lèi)(斑馬魚(yú)、虹鱒魚(yú))等物種具有很高的相似性，其中與香港巨牡蠣(Crassostreahongkongensis)相似性為89%，與櫛孔扇貝(Azμmapectenfarreri)相似性為85%，與小家鼠(Musmusculus)相似度80%，與斑馬魚(yú)(Daniorerio)相似性79%。

HSP90在細(xì)胞中表達(dá)豐度很高，甚至在無(wú)應(yīng)激條件下，在多數(shù)組織中也占有1%～2%的細(xì)胞蛋白總量[18]。它具有多種生物功能，如維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、維持類(lèi)固醇類(lèi)受體和轉(zhuǎn)錄因子、糾正蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊以及參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等重要的生理功能[19-22]。本研究中通過(guò)半定量RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測(cè)了hsp90基因在不同組織中的表達(dá)，與其他五種組織相比，在性腺中的表達(dá)量是最高的，這與其他研究者的研究結(jié)果相類(lèi)似[23-24]，這可能意味著hsp90基因與生殖器的生長(zhǎng)成熟有關(guān)。

HSP90與HSP70一樣具有分子伴侶的看家功能，參與細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白的折疊與裝配過(guò)程[25]。HSP90s是細(xì)胞中最重要的一種多功能應(yīng)激蛋白且被廣泛研究。在正常的細(xì)胞生理活動(dòng)，如細(xì)胞分裂，分化，發(fā)育中都能檢測(cè)到HSP90的表達(dá)。在應(yīng)激條件下hsp90的表達(dá)受到顯著刺激，表明它們的主要功能之一是保護(hù)細(xì)胞免受損傷[26-27]。本文通過(guò)典型多環(huán)芳烴芘對(duì)馬氏珠母貝采取染毒脅迫實(shí)驗(yàn)，采用熒光定量PCR手段檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間下hsp90基因在馬氏珠母貝肝胰腺組織中的變化情況。

肝胰腺作為雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物的解毒代謝器官，也是外源物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所。本研究發(fā)現(xiàn)在肝胰腺組織中，hsp90基因?qū)琶{迫所表現(xiàn)出的基因相對(duì)表達(dá)水平，主要表現(xiàn)出隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降的趨勢(shì)。在脅迫條件下，hsp90基因的表達(dá)上調(diào)是對(duì)脅迫影響機(jī)體所造成的變性蛋白質(zhì)增多做出的響應(yīng)機(jī)理[28]。在暴露后第1天和第5天，高濃度組hsp90表達(dá)水平與對(duì)照組相比表現(xiàn)出顯著的上調(diào)現(xiàn)象(p<0.05)，這與張俊鴻等研究發(fā)現(xiàn)焦?fàn)t工高劑量組淋巴水平hsp90水平高于對(duì)照組和低劑量組相似[29]。高濃度組引起hsp90顯著上調(diào)可能是誘導(dǎo)了細(xì)胞色素P450相關(guān)系統(tǒng)產(chǎn)生解毒代謝過(guò)程，發(fā)生氧化應(yīng)激，致使細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的氧化自由基ROS，進(jìn)而誘導(dǎo)hsps基因家族的表達(dá)[30]。在本研究中隨著芘暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，hsp90基因表達(dá)量逐漸恢復(fù)到正常水平，這可能是由于機(jī)體逐漸適應(yīng)環(huán)境，體內(nèi)基本已恢復(fù)平衡。芘暴露下hsp90基因上調(diào)是生物體自我保護(hù)的一種反應(yīng)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)hsp90基因的上調(diào)與芘濃度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)，這一劑量-效應(yīng)關(guān)系與鄭森林等報(bào)道的苯并芘誘導(dǎo)蚯蚓hsp90基因的上調(diào)相似[28]。

本文通過(guò)設(shè)計(jì)近緣物種的簡(jiǎn)并引物以及RACE手段擴(kuò)增得到了馬氏珠母貝hsp90基因cDNA全長(zhǎng)序列。采用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)芘脅迫對(duì)馬氏珠母貝hsp90基因的轉(zhuǎn)錄具有一定的上調(diào)作用，熱休克蛋白在環(huán)境外源物刺激的情況下所作出的反應(yīng)是保護(hù)機(jī)體免受芘脅迫污染的自我保護(hù)應(yīng)答。在芘脅迫馬氏珠母貝中，hsp90基因在肝胰腺中表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系， 因此，hsp90基因可作為環(huán)境應(yīng)激與毒性的一種理想的生物標(biāo)志物。

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