王 璐，惠秀娟，李雙雙，徐成斌，陳忠林，何 蕾

遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽(yáng) 110036

黃連素(berberine)又名小檗堿，是存在于小檗科、罌栗科、毛莨科、蕓香科和防己科等植物中的一種黃色的異喹啉類生物堿[1-3]，具有廣泛的生物學(xué)作用。小檗堿因所含取代基的不同常表現(xiàn)為鹽酸小檗堿與硫酸小檗堿兩種形式，我們臨床中常使用的清熱解毒和抗菌類治療藥物其主要成分多為鹽酸小檗堿。國(guó)內(nèi)外對(duì)于鹽酸小檗堿藥用價(jià)值的研究已證實(shí)，鹽酸小檗堿具有抗腫瘤、降血糖、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[4-5]。同時(shí)作為廣譜抗生素的一種，它能抑制多種革蘭氏陰性菌G-、革蘭氏陽(yáng)性菌G+以及真菌的生長(zhǎng)繁殖[6]。

但是研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿也表現(xiàn)出一定的毒副作用。由于鹽酸小檗堿快速的殺菌、消炎作用[7-8]，鹽酸小檗堿作為抗菌性藥物，被大劑量的添加在飼料中，以促進(jìn)牛、豬等抗病而快速生長(zhǎng)；調(diào)查結(jié)果顯示全球每年生產(chǎn)的抗菌類藥物(鹽酸小檗堿、土霉素、水楊酸等)中，約有60%被用來(lái)作為生長(zhǎng)劑及治療藥物飼喂動(dòng)物。此類藥物進(jìn)入生物體后，并不能完全被吸收，其中80%以上以原藥形式排出體外，有些抗菌性藥物在生物體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，生成毒性更大的代謝物隨糞便和尿液排出體外。這些抗菌藥及其代謝物隨雨水地表徑流污染地表水，或通過(guò)滲濾作用污染地下水。盡管濃度很低，但由于其在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中被長(zhǎng)期、大量、頻繁的施用，因此，對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成極大的潛在威脅。在排放入環(huán)境水體的合成鹽酸小檗堿的沖洗廢水中，調(diào)查結(jié)果顯示鹽酸小檗堿的濃度高達(dá)1 000 mg·L-1左右。

鹽酸小檗堿也能呈濃度依賴性地誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)和小腦顆粒神經(jīng)元壞死[9]。在一定濃度范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿會(huì)對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖具有抑制作用[10]。脾是血液循環(huán)中重要的濾過(guò)器，它能清除血液中的異物、病菌以及衰老死亡的細(xì)胞，同時(shí)也是人和動(dòng)物的重要外周免疫器官，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮免疫作用。藥理以及毒理等多種實(shí)驗(yàn)中，都把脾作為靶器官進(jìn)行研究。因而，為了深入研究鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞的損傷作用以及其潛在的環(huán)境影響，本研究從細(xì)胞及分子水平上，以小鼠脾細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)及抗氧化酶實(shí)驗(yàn)研究鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞的DNA損傷和氧化性損傷，為進(jìn)一步研究鹽酸小檗堿的遺傳毒性、毒性機(jī)理以及具體氧化性應(yīng)激反應(yīng)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸小檗堿為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司)；溴化乙錠(EB)，正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)，二甲亞砜(DMSO)，過(guò)氧化氫(H2O2)，硫代巴比妥酸等(美國(guó)Sigma 公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)選擇ICR雄性小鼠(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重25～30 g 左右，常規(guī)喂養(yǎng)兩周后選取健康的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按SAS隨機(jī)分組程序?qū)⑿∈箅S機(jī)分為7組，即對(duì)照組和7.5、15、30、60 和120 mg·kg-1鹽酸小檗堿劑量組。采用灌胃方式染毒，末次染毒6 h 后處死小鼠。按文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行取材、處理。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 彗星實(shí)驗(yàn)

參照Singn等人的彗星實(shí)驗(yàn)方法[12]，并適當(dāng)加以改動(dòng)[13-14]。熒光顯微鏡下用515～560 nm的激發(fā)光觀察，每張玻片用圖像采集系統(tǒng)在×200下隨機(jī)采集50個(gè)彗星圖像，用CASP(Comet Assay Software Project)圖像分析軟件測(cè)定尾部DNA含量、尾長(zhǎng)和尾矩。

1.3.2 生化測(cè)定

參照楊曉霞等人的實(shí)驗(yàn)方法。SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；POD采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；CAT 活性采用羥胺氧化法測(cè)定；MDA使用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定[15-18]。SOD、POD和CAT比活用每mg蛋白酶活單位(U)表示，MDA結(jié)果以單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中能與TBA反應(yīng)的物質(zhì)(TBARS)的納摩爾數(shù)(nmol·g-1)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行Tukey多重比較檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Mean±SD表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 體外彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞的體外彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。從表1可見(jiàn)，體外給予10 mg·L-1鹽酸小檗堿后，小鼠脾細(xì)胞尾部DNA含量、尾長(zhǎng)和尾矩即明顯增加(p<0.01)。表明鹽酸小檗堿造成了小鼠脾細(xì)胞DNA損傷。且隨鹽酸小檗堿濃度的增高，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)

鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞的體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。從表中可見(jiàn)，5個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組相比，尾部DNA含量、尾長(zhǎng)及尾矩均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，當(dāng)濃度增加至30 mg·kg-1后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。說(shuō)明一定劑量的鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞DNA有損傷作用。隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，小鼠脾細(xì)胞尾部DNA含量、尾長(zhǎng)、尾矩都呈現(xiàn)增加趨勢(shì), 且與濃度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。使用臺(tái)盼蘭進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)定時(shí)，實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞存活率均在95%以上，染毒后的細(xì)胞存活率也在90%以上，說(shuō)明DNA損傷為受試物作用所致，而非細(xì)胞毒性。

2.3 鹽酸小檗堿對(duì)小鼠組織內(nèi)SOD、CAT、POD活力以及MDA含量的影響

不同劑量鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞SOD、CAT、POD活性以及MDA濃度的影響如圖1-4。數(shù)據(jù)表明，高劑量的鹽酸小檗堿能夠抑制抗氧化酶的活性。隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，SOD與CAT活性逐漸降低，與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)。POD活性在7.5 mg·kg-1時(shí)，活性被激活，活性增加極顯著(p<0.01)。MDA含量隨鹽酸小檗堿濃度的增加呈上升趨勢(shì)，且與濃度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1 鹽酸小檗堿體外彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 1 The results of comet assay(x±s)

注：與陰性對(duì)照組相比，ap<0.05，bp<0.01。

Note：Significant differences from the control are indicated asap<0.05,bp<0.01.

表2 鹽酸小檗堿體內(nèi)彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 2 The results of comet assay(x±s)

注：與陰性對(duì)照組相比，ap<0.05，bp<0.01。

Note：Significant differences from the control are indicated asap<0.05,bp<0.01.

圖1 不同劑量下染毒后小鼠細(xì)胞SOD變化情況Fig. 1 The change of SOD activity after exposure to different concentrations of berberine

圖2 不同劑量下染毒后小鼠細(xì)胞POD變化情況Fig. 2 The change of POD activity after exposure to different concentrations of berberine

圖3 不同劑量下染毒后小鼠細(xì)胞CAT變化情況Fig. 3 The change of CAT activity after exposure to different concentrations of berberine

圖4 不同劑量下染毒后小鼠細(xì)胞MDA變化情況Fig. 4 The change of MDA activity after exposure to different concentrations of berberine

3 討論(Discussion)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定劑量的鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞有明顯的DNA損傷與氧化性損傷作用。彗星實(shí)驗(yàn)中，隨著鹽酸小檗堿濃度的增加，小鼠脾細(xì)胞DNA單鏈斷裂增多，電泳后，隨電子遷移的距離也明顯增大。脾細(xì)胞受損度增高，尾部DNA含量，尾長(zhǎng)、尾矩均增加，與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。可得出在一定劑量范圍內(nèi)鹽酸小檗堿能夠引起小鼠脾細(xì)胞的DNA損傷，對(duì)小鼠具有一定的遺傳毒性。但其造成損傷的機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

且小鼠脾細(xì)胞中MDA含量明顯上升，SOD與CAT 活性逐漸降低，POD活性在7.5 mg·kg-1時(shí)上升，而后逐漸下降。30 mg·kg-1后，活性變化與對(duì)照組相比，差異顯著(p<0.05)。說(shuō)明在低劑量時(shí)，小鼠脾細(xì)胞自身有抵御損傷的作用，能夠有效地清除自由基和活性氧，使細(xì)胞免受損傷。但當(dāng)劑量升高后，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了大量的自由基在小鼠體內(nèi)積累，未能被及時(shí)清除的自由基降低了抗氧化酶系的活性，同時(shí)加重了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，也進(jìn)一步說(shuō)明了鹽酸小檗堿可導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞DNA損傷。但對(duì)于長(zhǎng)期條件下小鼠脾細(xì)胞的抗氧化酶系的活性以及MDA含量變化等情況還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，彗星實(shí)驗(yàn)、抗氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較好的一致性，能夠有效地證明鹽酸小檗堿對(duì)小鼠脾細(xì)胞的DNA損傷與氧化性損傷作用。為鹽酸小檗堿進(jìn)一步遺傳毒性的研究以及后續(xù)機(jī)理研究提供相關(guān)依據(jù)。

致謝：感謝遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院各位老師、同學(xué)的幫助和支持。

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