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(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

乳腺癌作為最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率居高不下。2012年美國A Cancer Journal for Clinicians公布的數(shù)據(jù)顯示,預(yù)計(jì)2022年美國乳腺癌患病率為41%,與宮頸癌(8%)、大腸癌(8%)相比,排名女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[1],在我國乳腺癌的患病率也比較高[2]。近年來,乳腺癌在治療方面取得了很大的進(jìn)展,但其易轉(zhuǎn)移、愈后易復(fù)發(fā)以及耐藥性的特點(diǎn)仍是治療乳腺癌的關(guān)鍵問題。納豆是用納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆制成的食品,與未發(fā)酵大豆相比,納豆中的大豆甙元和染料木素含量是發(fā)酵前的數(shù)十倍,而且在發(fā)酵過程中還產(chǎn)生降血脂、溶血栓作用的納豆激酶[3]以及具有良好表面活性的納豆脂肽[4]。目前國內(nèi)外對納豆脂肽的研究多集中于表面活性劑[4-7]、抗真菌[8-9]和抗細(xì)菌[10-13]方面,對其抗腫瘤[14]活性研究的較少。本論文從納豆發(fā)酵液中提取純化得到納豆脂肽,研究其對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌 由本實(shí)驗(yàn)室從納豆發(fā)酵液中提取;人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 北京中醫(yī)藥大學(xué);胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25% EDTA-胰酶 美國Gbico;MTT(溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑)、DMSO 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 南京凱基生物有限公司;細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

HZQ-X100恒溫震蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;GI54DWS高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY;5804R高速離心機(jī) 德國eppendorf;DMI6000B活細(xì)胞工作站 德國Leica;SG603A-HE-INT生物安全柜 美國BAKER公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國BD Biasciences。

表1 納豆脂肽對MCF-7細(xì)胞增殖的影響Table1 Effect of natto lipopetide on the cell proliferation of MCF-7

1.2 納豆脂肽的提取和純化

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基配制參考曹小紅[11]的文獻(xiàn)。配制好的培養(yǎng)基,121℃下滅菌20min。

1.2.2 納豆芽孢桿菌的培養(yǎng) 納豆芽孢桿菌活化2～3次后,接種于種子液培養(yǎng)基,35℃,140r/min搖床培養(yǎng)24h。將種子液以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,35℃,140r/min搖床培養(yǎng)48h。

1.2.3 納豆脂肽的提取純化 脂肽提取純化方法參考呂應(yīng)年[15]的文獻(xiàn)。發(fā)酵液4℃,10000r/min,離心10min,收集上清液用濃鹽酸調(diào)pH2.0,4℃靜置后離心收集沉淀。加適量NaOH使沉淀溶解,再加活性炭吸附,離心取上清液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得褐色固體。所得固體用二氯甲烷索式抽提12h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉二氯甲烷,得納豆脂肽粗提物,記為N1。

將粗品N1溶于適量丙酮中,浸提過夜后超聲3h,4℃,10000r/min,離心20min得上清液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉上清液,所得固體即為納豆脂肽,記為N2。

取少量N1和N2溶于二氯甲烷,點(diǎn)樣于薄層硅膠板,在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)的展開劑中展開,噴水顯色。

1.3 納豆脂肽誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的作用

1.3.1 MCF-7的培養(yǎng)與傳代 將MCF-7培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿80%時(shí),胰酶消化,按1∶3的比例傳代。

1.3.2 納豆脂肽對MCF-7的體外增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTT法測定納豆脂肽對MCF-7體外增殖的抑制情況。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞2×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板上。設(shè)置不同濃度的實(shí)驗(yàn)組(0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL)和空白對照組,各組設(shè)6個(gè)平行孔。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的脂肽,培養(yǎng)12h。然后每孔加MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸取上清,加150μL DMSO,吹打均勻,在波長570nm處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值,計(jì)算抑制率(IR)和半數(shù)致死濃度(IC50)。其中抑制率的計(jì)算公式為:

1.3.3 納豆脂肽對MCF-7細(xì)胞凋亡和周期的影響 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞1×105個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板上。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的脂肽(0、1、2、4μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)12h。參照AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明書,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,單因素方差分析,p<0.05表示有顯著性差異,p<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆脂肽的分離純化

提取純化后,N1、N2的得率分別是0.029g/L和0.021g/L。其薄層結(jié)果見圖1。

圖1 納豆脂肽的薄層分析 Fig.1 TLC analysis of the natto lipopeptide

2.2 納豆脂肽對MCF-7存活率的影響

表1表明,納豆脂肽濃度為0.25、0.5μg/mL時(shí),對MCF-7存活率的影響不顯著。當(dāng)濃度為1、2、4、8μg/mL時(shí),對MCF-7存活率的影響顯著(p<0.05),且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,12h的IC50是3.68μg/mL。

2.3 納豆脂肽對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2為不同濃度納豆脂肽作用MCF-7細(xì)胞12h后的細(xì)胞形態(tài)。正常細(xì)胞呈不規(guī)則梭形,隨著納豆脂肽濃度的增大,細(xì)胞數(shù)量不斷減少且形態(tài)上逐漸皺縮變?yōu)閳A形。

圖2 納豆脂肽作用MCF-7細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)(×200) Fig.2 Cell morphology of MCF-7 after being treated with natto lipopeptide(×200)

2.4 納豆脂肽對MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

表2表明,納豆脂肽濃度為1、2、4μg/mL時(shí),與空白對照組(0.32%)相比,MCF-7細(xì)胞的凋亡率顯著升高,分別為8.47%、9.47%和31.04%(p<0.05),且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 納豆脂肽作用MCF-7細(xì)胞后的凋亡率Table 2 Apoptosis rate of MCF-7 after being treated with natto

2.5 納豆脂肽對MCF-7細(xì)胞周期的影響

表3表明,納豆脂肽(0、1、2、4μg/mL)作用MCF-7細(xì)胞12h后細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變:G0/G1期細(xì)胞所占百分比從68.17%下將至47.98%;S期細(xì)胞所占百分從19.72%上升至41.04%,表明納豆脂肽可以在將細(xì)胞周期阻滯在S期。

表3 納豆脂肽作用MCF-7細(xì)胞后的 細(xì)胞周期分布Table 3 Cell cycle distribution of MCF-7 after being treated with natto

3 討論

納豆中含有的脂肽類物質(zhì)主要有surfactin、Iturin、Fengycin。其中surfactin由一個(gè)七肽和β-羥基脂肪酸組成,其作用機(jī)理可能是surfactin嵌入到磷脂雙分子層中,改變靶細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性和脂肪酸組成,造成脂膜的破壞[16-17],進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[18-19]。乳腺癌作為發(fā)病率較高的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性的健康,因此開發(fā)研究抗乳腺癌藥物在預(yù)防和治療乳腺癌方面具有重要的意義。但是目前國內(nèi)外對脂肽在抑制乳腺癌方面的研究較少,曹小紅等人[20]發(fā)現(xiàn)surfactin可以抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖,作用MCF-7細(xì)胞24h后的IC50是27.3μmol/L。本次實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)納豆脂肽對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖有抑制作用,并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,且12h后的IC50是3.68μg/mL。通過活細(xì)胞工作站鏡檢和流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,證實(shí)納豆脂肽可使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡,并將細(xì)胞周期阻滯在S期,其誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的機(jī)理將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。

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