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(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北保定 071001)

苦菜Ierischinxensis(Thunb.)Nakai又名山苦菜、中華苦荬菜,是菊科苦荬菜屬植物[1]?？嗖撕胸S富的營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用,也是一種藥食同源的植物[2],具有清熱、解毒、消炎、涼血、止痛、消腫、抗腫瘤等功效?？嗖嗽谖覈植紡V泛,野生資源豐富,食用、藥用歷史悠久,化學(xué)成分及藥理作用復(fù)雜[3-6]。

趙云玲等[7]以生理鹽水為對照,對煙堿中毒的小白鼠和家兔分別用苦菜干品口服液、注射液、鮮品口服液進(jìn)行解毒實驗,實驗結(jié)果表明,苦菜鮮品口服液對煙堿中毒家兔和小白鼠具有明顯的解救作用。通過這一實驗,初步證明了苦菜的抗煙堿作用;許光鴻[8]嘗試用苦菜治療家畜煙堿中毒,取得了較好的療效。但是,這些研究只是通過對動物煙堿中毒的癥狀進(jìn)行簡單的觀察實驗,并沒有任何客觀指標(biāo)的研究。乙酰膽堿是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),尼古丁作用于煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs),急性給予尼古丁引起α4β2亞型和α7亞型nAChRs功能性上調(diào),使突觸前膜去極化增強(qiáng),Ca2+內(nèi)流增加,突觸傳遞增強(qiáng),從而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放[9]。因此,本研究以小鼠血清乙酰膽堿的含量作為觀察指標(biāo),探索苦菜對尼古丁中毒的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠(18～22g) 北京阜康生物科技有限公司;苦菜 采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū),經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)系馮大領(lǐng)老師鑒定為菊科苦荬菜屬植物苦菜Ierischinxensis(Thunb.)Nakai;99%尼古丁 陜西弘康生物科技有限公司提供;乙酰膽堿(Ach)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;無水乙醇 天津市進(jìn)豐化工有限公司。

JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 金壇市杰瑞爾電器有限公司;臺式高速離心機(jī) 德國艾本德股份公司;RE_52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Thermo Scientific全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo fisher scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠尼古丁中毒癥狀觀察 取9只小鼠,隨機(jī)分為3組,每組3只。分別注射0.12、0.3、0.6mg/mL的尼古丁溶液,注射量均為0.1mL/10g·bw,觀察小鼠中毒軀體癥狀、重新開始活動時間、注射后第一次進(jìn)食時間。

1.2.2 苦菜對尼古丁中毒小鼠的血清乙酰膽堿含量的影響 120只小鼠隨機(jī)分為尼古丁組、苦菜汁組和空白組,每組40只又按時間點分為5組,每組每個時間點8只小鼠。尼古丁組和苦菜汁組背部皮下注射0.6mg/mL的尼古丁溶液,空白組背部皮下注射0.9%氯化鈉注射液,注射劑量均為0.1mL/10g·bw。每只小鼠注射后馬上灌胃,尼古丁組和空白組灌胃自來水,苦菜汁組灌胃苦菜汁,灌胃劑量均為0.2mL/10g·bw?？嗖酥瓰槿晷迈r苦菜100g加自來水100mL經(jīng)組織搗碎勻漿機(jī)、尼龍紗布過濾所得濾液。每組小鼠在灌胃后5、15、30、45、60min分別摘眼球取血。血液凝固后于4℃,3500r/min離心15min,分離血清,-28℃冰箱冷凍保存待測。

1.2.3 苦菜不同部位對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響 32只小鼠隨機(jī)分為尼古丁組、苦菜葉組、苦菜根組和空白組,每組8只小鼠?？瞻捉M背部皮下注射0.9%氯化鈉注射液,其余三組均背部皮下注射0.6mg/mL的尼古丁溶液,注射量均為0.1mL/10g·bw。注射后即刻灌胃,尼古丁組和空白組灌胃自來水,其他組灌胃相應(yīng)的苦菜樣品,灌胃量均為0.2mL/10g·bw?？嗖巳~汁為新鮮苦菜葉100g加自來水100mL經(jīng)組織搗碎勻漿機(jī)、尼龍紗布過濾所得濾液。苦菜根汁為新鮮苦菜根100g加自來水100mL經(jīng)組織搗碎勻漿機(jī)、尼龍紗布過濾所得濾液。在灌胃后45min摘眼球取血。制備血清,同1.2.2。

1.2.4 苦菜提取物對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響 32只小鼠隨機(jī)分為尼古丁組、干提物組、鮮提物組和空白組,每組8只小鼠。干苦菜提取物(干提物)為新鮮苦菜經(jīng)真空冷凍干燥、中藥粉碎機(jī)粉碎成粉,取50g,按料液比1∶8加入60%乙醇溶液,超聲提取1h,40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去乙醇后所剩液體。鮮苦菜提取物(鮮提物)為新鮮苦菜50g,按料液比1∶8加入60%乙醇溶液,超聲提取1h,40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去乙醇所剩液體。各組處理同1.2.3。在灌胃后45min摘眼球取血。制備血清,同1.2.2。

1.2.5 指標(biāo)測定方法 血清乙酰膽堿含量測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠尼古丁中毒劑量選擇

小鼠注射尼古丁后,迅速出現(xiàn)中毒癥狀。注射低劑量尼古丁溶液(0.12mg/mL)后,自發(fā)活動先小幅度增加,后減少,只在小范圍活動,并出現(xiàn)撓頭、豎起、舔爪等癥狀;注射0.3mg/mL尼古丁溶液后,小鼠活動先迅速增加,然后減少至停下不動,并出現(xiàn)翹尾、呼吸困難、頭部上仰、弓背、瞇眼、間隔性抽搐等癥狀;注射0.6mg/mL尼古丁溶液后,癥狀與前者相似。但重新開始活動時間和第一次進(jìn)食時間如表1所示。由觀察結(jié)果可見注射0.3mg/mL和0.6mg/mL尼古丁溶液后中毒癥狀明顯,考慮灌胃消化時間,選擇0.6mg/mL為皮下注射劑量。

表1 小鼠尼古丁中毒癥狀Table 1 Symptoms of nicotine poisoning in mouse

2.2 苦菜汁對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響

結(jié)果如圖1所示。與空白組相比,給藥后,尼古丁組和苦菜組小鼠血清乙酰膽堿含量明顯升高,并隨時間延長而降到正常水平。尼古丁組在灌胃后5、15、30、45min,分別高出空白組9%、33%、14%、32%,方差分析結(jié)果表明在灌胃后5、15、30、45min與空白組相比均有顯著性差異(p<0.05);苦菜組小鼠血清乙酰膽堿含量在前期與尼古丁組趨勢相似,但在45min時小鼠血清乙酰膽堿含量低于尼古丁組11%,與尼古丁組有顯著性差異(p<0.05),所以選擇灌胃后45min作為后續(xù)實驗的取血時間;在60min時,三組小鼠血清乙酰膽堿含量之間無顯著性差異。實驗結(jié)果表明苦菜汁對尼古丁中毒小鼠出現(xiàn)的血清乙酰膽堿含量升高有一定抑制作用。

圖1 苦菜對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響 Fig. 1 The effect of Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai juice on serum acetylcholine content in mouse

2.3 苦菜不同部位對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響

結(jié)果如圖2所示。在灌胃后45min時,尼古丁組小鼠血清乙酰膽堿含量高出空白組30%,與2.2結(jié)果相近,說明小鼠已中毒。與尼古丁組相比,在灌胃后45min時,苦菜葉組和苦菜根組小鼠乙酰膽堿含量明顯降低,但高于空白組。方差分析結(jié)果表明苦菜葉組和苦菜根組與尼古丁組小鼠血清乙酰膽堿含量之間有顯著性差異(p<0.05),且苦菜葉組和苦菜根組與空白組小鼠血清乙酰膽堿含量之間有顯著性差異(p<0.05),苦菜根組與苦菜葉組之間無顯著性差異(p>0.05)。實驗結(jié)果表明苦菜的根和葉都對尼古丁中毒小鼠出現(xiàn)的血清乙酰膽堿含量升高有一定抑制作用。

圖2 苦菜不同部位對尼古丁中毒 小鼠血清乙酰膽堿含量的影響 Fig.2 The effect of different part of Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai on serum acetylcholine content in mouse

2.4 苦菜提取物對尼古丁中毒小鼠血清乙酰膽堿含量的影響

結(jié)果如圖3所示。在灌胃后45min時,尼古丁組小鼠血清乙酰膽堿含量高出空白組35%,與2.2和2.3結(jié)果相近,說明小鼠已中毒。與尼古丁組相比,在灌胃后45min時,苦菜干提物組和鮮提物組小鼠血清乙酰膽堿含量明顯降低,但高于空白組。方差分析結(jié)果表明苦菜干提物組和苦菜鮮提物組與尼古丁組小鼠血清乙酰膽堿含量之間有顯著性差異(p<0.05),且苦菜干提取物組和苦菜鮮提取物組組與空白組小鼠血清乙酰膽堿含量之間有顯著性差異(p<0.05),苦菜干提取物組和苦菜鮮提取物組之間無顯著性差異(p>0.05)。實驗結(jié)果表明干苦菜提取物和鮮苦菜提取物都對尼古丁中毒小鼠出現(xiàn)的血清乙酰膽堿含量升高有一定抑制作用。

圖3 苦菜提取物對尼古丁中毒 小鼠血清乙酰膽堿含量的影響 Fig.3 The effect of extractive from Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai on serum acetylcholine content in mouse

3 結(jié)論

尼古丁可引起機(jī)體乙酰膽堿釋放增加[10],繼而出現(xiàn)中毒癥狀。當(dāng)機(jī)體受尼古丁作用時,可引起支配橫紋肌的運(yùn)動神經(jīng)末梢和交感神經(jīng)節(jié)前纖維(包括支配腎上腺髓質(zhì)的交感神經(jīng))等膽堿能神經(jīng)發(fā)生興奮,但乙酰膽堿蓄積過多時,則將轉(zhuǎn)為麻痹,具體表現(xiàn)為肌纖維性震顫,血壓上升,肌緊張度減退(特別是呼吸肌)、脈搏頻數(shù)減少等。這與本實驗中尼古丁中毒癥狀觀察結(jié)果相符。

趙云玲等[7]以存活率為指標(biāo),證明苦菜作成的口服制劑,對煙堿中毒家兔和小白鼠口服應(yīng)用具有明顯的解救作用,許光鴻[8]通過牛、豬、狗的尼古丁中毒病例說明用苦菜治療動物煙堿中毒可取得較好的效果。本研究與其不同之處在于用小鼠血清乙酰膽堿含量為指標(biāo)評價了苦菜對尼古丁中毒的解毒作用,實驗中小鼠中毒而未死亡,為研究苦菜對尼古丁慢性中毒的影響提供一定參考,而且比較了苦菜根和葉的解毒作用,針對有效成分易被破壞的問題,嘗試了真空冷凍干燥苦菜,效果良好,為以后的苦菜研究以及苦菜的開發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明,尼古丁中毒小鼠灌胃苦菜及其提取物后,血清乙酰膽堿含量顯著降低,表明苦菜可拮抗尼古丁對小鼠毒性,且有效成分存在于苦菜全株各部分,真空冷凍干燥可以很好保存苦菜的有效成分,有效成分可用60%乙醇溶液提取。但是,結(jié)果還顯示各樣品組血清乙酰膽堿含量與空白組仍明顯偏高,說明苦菜對急性尼古丁中毒動物的解毒能力有限。因此,本研究結(jié)果提示苦菜對尼古丁急性中毒有一定的拮抗作用。但究竟是苦菜中的何種成分在起作用,作用機(jī)理如何,都還需要進(jìn)行深入研究。而且,苦菜是否可對尼古丁上癮進(jìn)行干預(yù),也將是我們下一步研究內(nèi)容。

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