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(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心,天津農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室,天津 300384)

交鏈孢菌(Alternariasp.)是引起鮮食葡萄采后腐爛變質(zhì)的主要病原菌,尤其在低溫冷藏及貨架銷售過程中發(fā)病嚴(yán)重,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研發(fā)科學(xué)、安全的葡萄采后交鏈孢菌抑制劑已經(jīng)成為解決鮮食葡萄采后保鮮問題的關(guān)鍵手段之一[1]。

納他霉素(Natamycin)是納他爾鏈霉菌(Strepto-mycin natalensis)經(jīng)發(fā)酵得到的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑,能有效抑制霉菌和酵母菌的生長[2-3]。在急性毒性、亞慢性毒性實驗中均證明納他霉素對動物無損害[3],是美國食品和藥物管理局(FDA)正式批準(zhǔn)的2種生物防腐劑之一,已成為許多國家廣泛使用的一種天然生物源食品防腐劑和抗菌添加劑[4],我國衛(wèi)生部也正式批準(zhǔn)納他霉素作為食品防腐劑[5]。目前,納他霉素應(yīng)用研究多集中在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[6],納他霉素已在甜櫻桃、草莓、冬棗、葡萄和蘆筍等果蔬保鮮上有所應(yīng)用[7-10],但沒有應(yīng)用于葡萄采后交鏈孢菌的防腐保鮮的研究。因此,本實驗通過研究納他霉素對鮮食葡萄采后交鏈孢菌的抑制作用,初步明確其抑菌效果及防病效果,希望為新型葡萄生物保鮮劑的開發(fā)提供切實的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄試材 于2012年9月采自天津濱海茶淀葡萄科技園,采收前未使用化學(xué)殺菌劑;供試菌從貯藏期內(nèi)發(fā)病葡萄果實上分離得到,依據(jù)方中達(dá)[11]方法進(jìn)行室內(nèi)分離、純化,培養(yǎng)后反接到葡萄上,待發(fā)病后再分離、純化培養(yǎng),經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定和顯微觀察證實為交鏈孢菌(Alternariasp.)[12]。

表1 不同濃度納他霉素對葡萄交鏈孢菌菌絲生長量的影響(cm)Table 1 Effect of natamycin on hypha growth rate of grape Alternaria in different concentrations(cm)

95%的納他霉素(Natamycin)原粉 由北京東方瑞德生物技術(shù)公司提供;藥劑配制參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定實驗準(zhǔn)則》[13];納他霉素用0.1mol/L鹽酸無菌水溶液配成10000mg/L的母液,在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

電子天平BP210S 德國Sartorious;顯微鏡BX51 日本Olympus公司;超凈工作臺SW-CJ-1FD 蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司;智能型生化培養(yǎng)箱SPX-250B 上?，槴\實驗室設(shè)備有限公司。

1.2 處理及方法

1.2.1 不同濃度納他霉素對葡萄交鏈孢菌菌絲生長的抑制作用 實驗前,將含0.01%吐溫-80的0.1mol/L鹽酸無菌水溶液進(jìn)行菌培養(yǎng)作為預(yù)實驗,實驗證明此處理對菌生長無影響,因此,以此作為對照(CK)。實驗處理參照菌絲生長速率法[14],將母液使用含0.01%吐溫-80的0.1mol/L鹽酸無菌水溶液分別稀釋為濃度50、100、150、200mg/L備用。每個濃度設(shè)3個重復(fù),25℃下培養(yǎng)1d 后,每天測量一次菌落直徑,采用十字交叉法測量菌落擴(kuò)展直徑,連續(xù)測定7d;分別求出各處理濃度對菌落的抑制率,用DPS統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程及EC50值[15]。

抑制生長率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×100

1.2.2 不同濃度納他霉素對葡萄交鏈孢菌孢子萌發(fā)率的抑制作用 采用懸滴法[16]測定,藥劑配制同1.2.1。以等量含0.01%吐溫-80的0.1mol/L鹽酸無菌水溶液為對照,12h后鏡檢孢子萌發(fā)率,以孢子芽管的長度超過孢子直徑長度的一半作為已經(jīng)萌發(fā)的孢子。每個處理重復(fù)3次,各重復(fù)在顯微鏡下檢測100個以上的孢子囊,計算校正孢子萌發(fā)抑制率。用DPS統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程及EC50值[14]。

孢子萌發(fā)率(%)=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(1-藥劑處理的孢子萌發(fā)率/對照的孢子萌發(fā)率)×100

1.2.3 不同濃度納他霉素對活體接種果實葡萄交鏈孢的防效評價

1.2.3.1 無損傷接種 先將 PDA 上純化的交鏈孢菌配成濃度為 1×106個/mL的孢子懸浮液,再挑選大小整齊、無損傷的帶柄玫瑰香葡萄果粒先在0、50、150、150、200mg/L的抑菌液中浸泡30s,再放入上述交鏈孢菌孢子懸浮液中浸果2min,取出自然晾干后裝入PE袋中,扎緊袋口,恒溫箱(25±2)℃下貯藏,空白對照采用含0.01吐溫-80的0.1mol/L鹽酸無菌水浸果。每處理 50個果實,設(shè)3個重復(fù),5d后觀察發(fā)病情況。

1.2.3.2 損傷接種 孢子懸浮液配制同上,用直徑2mm 的滅菌鐵釘在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇表面消毒的葡萄果實中部分別刺孔2個,深度為4mm,然后用微量注射器吸取10μL 孢子懸浮液注入刺口處,接種后的果實經(jīng)1h后放入抑菌液中浸泡30s,取出自然晾干后裝入PE袋中,扎緊袋口,恒溫箱(25±2)℃下貯藏,觀察5d的病斑直徑變化情況,用十字交叉法測量病斑直徑。空白對照采用0.1mol/L鹽酸鹽酸無菌水浸果。每處理 50個果實,設(shè)3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

文中所用數(shù)據(jù)均采用Excel 2003轉(zhuǎn)化為折線圖,采用DPS 7.05統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度納他霉素抑菌液對葡萄采后交鏈孢菌菌絲生長的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長,各處理菌絲生長量都呈上升的趨勢。培養(yǎng)至第7d各處理菌落生長情況如表1所示,CK處理的菌絲生長量顯著(p<0.05)高于其他納他霉素處理,且隨著納他霉素濃度增大,菌絲生長量逐漸減小。

2.2 不同濃度納他霉素抑菌液對葡萄采后交鏈孢菌菌絲生長抑制率的影響

從圖1可知,從接種后第3d開始,隨著處理濃度的增加,納他霉素對葡萄采后交連孢菌的抑菌率逐漸增大;從接種后2～7d,200mg/L的抑菌液處理對菌絲生長的抑制率均大于80%,依次為82.15%、86.11%、87.37%、88.61%、88.72%和89.96%,其他3個濃度的抑菌液對菌絲生長的抑制率也在56.35%～81.67%之間。通過計算得到抑制毒力方程為Y=16.701+0.3989X(X代表納他霉素抑菌液濃度,Y代表菌絲生長抑制率),R2=0.8454。EC50為83.48mg/L。由此說明,200mg/L納他霉素對葡萄交鏈孢菌菌絲生長有很好的抑制作用。

圖1 不同濃度納他霉素 對葡萄交鏈孢菌菌絲生長抑制效果 Fig.1 The inhibitory effects of natamycin on mycelial growth of grape Alternaria in different concentrations

2.3 不同濃度下納他霉素對葡萄交鏈孢孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知,不同濃度藥劑對葡萄交鏈孢孢子萌發(fā)均有抑制作用,萌發(fā)率均隨濃度的升高而減小,抑制萌發(fā)率則隨濃度的升高而增大;50、100、150和200mg/L納他霉素的孢子萌發(fā)率分別是CK的0.56、0.48、0.30和0.15,抑制萌發(fā)率分別達(dá)到了43.87%、51.82%、70.36%和85.41%,各濃度納他霉素處理的孢子萌發(fā)率和抑制萌發(fā)率均達(dá)到差異顯著水平(p<0.05)。通過計算得到納他霉素抑菌液對葡萄采后交鏈孢菌孢子萌發(fā)的抑制毒力方程為Y=82.774-0.3663X(X代表納他霉素抑菌液濃度,Y代表孢子萌發(fā)率),R2=0.925。 EC50為89.47mg/L,與抑制菌絲生長EC50值相接近。

圖2 不同濃度下納他霉素對葡萄交鏈孢孢子萌發(fā)的影響 Fig.2 Effects of natamycin on spore germination of grape Alternaria in different concentrations

2.4 不同濃度納他霉素對葡萄交鏈孢菌發(fā)病率的防效評價

由圖3可知,對于無傷接種培養(yǎng)5d的葡萄果實,隨著納他霉素濃度的增加葡萄交鏈孢菌引起的腐爛發(fā)病率逐漸減小,各處理間差異達(dá)極顯著水平(p<0.01),與對照相比200mg/L納他霉素處理發(fā)病率降低了41.18%。對于有傷接種的葡萄果實,隨著培養(yǎng)時間的延長,交鏈孢菌病斑直徑逐漸增大,且納他霉素的防病效果越來越顯著;培養(yǎng)1～3d時,納他霉素各處理病斑直徑均顯著小于對照,但各處理間差異不顯著(p<0.05);培養(yǎng)超過3d后,不同濃度納他霉素處理間差異逐漸明顯,其中200mg/L的納他霉素處理病斑直徑顯著(p<0.05)小于其他各處理。

圖3 不同濃度下納他霉素 對葡萄交鏈孢霉發(fā)病率的防效評價 Fig.3 Preventing effect evaluation of natamycin on incidence of grape Alternaria in different concentrations

3 結(jié)論與討論

有研究表明,納他霉素幾乎對所有真菌具有抑制和殺滅活性,能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長,阻止絲狀真菌中黃曲霉毒素的形成[17]。絕大多數(shù)霉菌在納他霉素濃度為0.5～6mg/kg時即被抑制,極個別菌種在10～25mg/kg時被抑制,多數(shù)酵母菌在1.0～5.0mg/kg時即被抑制[18]。本文研究結(jié)果表明,納他霉素對所試葡萄交鏈孢菌有較強(qiáng)的抑制作用,可以有效抑制交鏈孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā),而且隨著納他霉素濃度的升高,對葡萄交鏈孢菌的抑制活性也隨之提高。同時,適宜濃度納他霉素對于葡萄交鏈孢菌引起的采后腐爛具有較好的預(yù)防效果。這也在一定程度上再次驗證了前人的研究結(jié)論。

適宜濃度納他霉素對由交鏈孢菌引起的葡萄采后腐爛具有較好的預(yù)防作用,本實驗中當(dāng)抑菌液濃度達(dá)200mg/L時,對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率均達(dá)到80%以上,且活體接種實驗的抑菌效果也顯著,具有高效、無毒[17]、低殘留[19]等優(yōu)點。因此,可以研制開發(fā)適用于葡萄采前噴施的生物綠色防腐保鮮劑,從而有效控制交鏈孢霉的潛伏侵染及采后發(fā)病;此外,由于不同濃度納他霉素對葡萄交鏈孢菌抑菌效果存在差異,故在選擇納他霉素防腐劑用量時要注意合理使用濃度,達(dá)到最佳和最經(jīng)濟(jì)防腐效果,盡可能延長葡萄的保鮮期。

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