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(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇蘇州 215123;2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,江蘇蘇州 215128)

奶制品是以生鮮牛(羊)乳及其制品為主要原料,經(jīng)加工制成的各種食品。因其蛋白質(zhì)含量高,營養(yǎng)豐富而被人們喜愛,被認(rèn)為是廣大消費者的最佳營養(yǎng)補品。隨著人們生活水平的不斷提高,奶制品已成為人們生活中重要的組成部分。然而為牟取暴利,部分不法商販常以低成本的米粉(湯)、淀粉、糊精或植物蛋白摻入奶制品中冒充高價奶成分[1]。這種摻假行為不僅嚴(yán)重影響了奶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,而且降低了奶及奶制品中正常的營養(yǎng)價值,危害了消費者尤其是嬰幼兒群體的身心健康。因此,加強對奶制品摻雜摻假的監(jiān)督管理和檢驗,以確保消費者的合法權(quán)益及安全具有重要的意義。

目前檢測奶制品中的米粉(湯)、淀粉、糊精等摻假成分常采用感觀檢測和化學(xué)分析方法,但是該類方法具有人為判斷誤差大、靈敏度低、特異性差等缺點，已經(jīng)滿足不了市場監(jiān)督的需要[1-3]。實時熒光PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸技術(shù)。它不僅保留了普通PCR技術(shù)的特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點,而且還避免了普通PCR的需電泳、易污染、低通量的缺點,是分析食品成分及其來源的較好方法。鑒于大米是摻假成分淀粉、糊精及植物蛋白常見的原料之一[4],本研究擬建立實時熒光PCR技術(shù)檢測奶制品中摻入的大米源性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉、紅棗、菠蘿、草莓、西紅柿、核桃、大豆、花生、小麥、大麥、玉米、高粱、鮮牛奶、鮮羊奶、大米用于特異性檢測 市購;13份生鮮乳、2份嬰兒奶米粉、1份嬰兒配方羊奶粉、4份嬰兒配方牛奶粉、1份固體乳飲料 蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所提供;動物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;無水乙醇 分析純;TaqMan Universal PCR master mix 美國ABI公司;10×PCR buffer、Taq酶、dNTP Mixture、DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司。

5810 型臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;BioPhotometer plus 核酸蛋白含量測定儀 德國Eppendorf公司;7500 fast real time PCR儀 美國ABI公司;DKB-1915型恒溫水浴槽 BIO-RAD公司;ER-200A凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司;JFSD-100型粉碎機 上海日暉微電機廠等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 使用粉碎機將大豆、大米、玉米、高粱、大麥、小麥等樣品磨成粉狀,并過80目篩備用;采用組織研磨器處理香蕉等水果樣品。不同樣品分開處理,以防止交叉污染。

1.2.2 DNA提取 鮮牛奶、鮮羊奶等液體樣品[5]:取10mL樣品,1500×g離心15min,去上清;將沉淀重新懸浮于2mL PBS中,12000×g離心5min,如此重復(fù)3次,最終將沉淀懸浮于200μL PBS中。然后按照細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒進行。

水果樣品:按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟進行。

奶粉及其與大米粉的混合樣品、市售奶制品等其它樣品:按照細(xì)胞組織基因組DNA提取試劑盒進行,其步驟略作修改,使蛋白酶K消化過夜。

最終提取出OD260/OD280比值均在1.5～2.0之間的動植物組織DNA備用。

1.2.3 引物和探針 查閱文獻[6-10],兼顧方法的特異性及靈敏度,終選擇水稻的內(nèi)源性保守基因根部表達基因(gos9)作為靶基因(GenBank:D10956.1)。利用Primer express 3.0 軟件設(shè)計引物及探針,擴增目的片段長度為113bp。引物探針由上海生工生物工程技術(shù)公司合成,具體序列信息見表1。

PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 5μL,10μmol/L上、下游引物各5μL,2.5μmol/L dNTP 5μL,2U/μL Taq酶lμL,模板DNA 1μL,滅菌去離子水28μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性50s,65℃退火40s,72℃延伸40s,30個循環(huán);72℃延伸5min。PCR反應(yīng)結(jié)束后進行2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳。

表1 引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

1.2.4 實時熒光PCR反應(yīng) 實時熒光PCR采用25μL反應(yīng)體系:ABI Taqman Gene Expression Master Mix,12.5μL;上、下游引物,熒光標(biāo)記探針,各1μL,終濃度皆為 10μmol/L;模板 DNA 2μL;其余不足用滅菌雙蒸水補齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:50℃,2min;95℃,10min;95℃,15s;60℃,1min,40個循環(huán)。使用7500 software V2.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 特異性實驗 陰性對照組選擇市場上奶制品中最常添加的動植物源性成分:香蕉、紅棗、菠蘿、草莓、西紅柿、核桃、大豆、花生、小麥、大麥、玉米、高粱、牛奶、羊奶,陽性組選擇大米。提取其DNA模板,用滅菌雙蒸水稀釋至25ng/μL。各取2μL,各做3個平行,分別進行實時熒光 PCR 反應(yīng),以進行特異性實驗。

1.2.6 靈敏度實驗 取純大米DNA提取原液濃度約為 50ng/μL,按十倍倍比稀釋法進行稀釋,共7個稀釋度稀釋至0.0005ng/μL。各取2μL作為模板進行實時熒光PCR 反應(yīng)以檢測該方法的靈敏度。每個濃度檢測重復(fù)3次。

1.2.7 模擬樣品中大米成分檢測 為進一步評估該方法的靈敏度及可行性,將大米粉用全脂牛奶粉稀釋至質(zhì)量百分含量分別為5%、1%、0.5%、0.1% 制成4個濃度的模擬樣品。對每個混合樣品提取DNA模板,各3個平行進行實時熒光PCR反應(yīng),以檢驗該方法用于模擬樣品的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物有效性驗證

利用所設(shè)計的引物,對大米模板DNA 進行PCR擴增后電泳分析。由圖1可以看出,4個大米樣品皆擴增出約113bp的DNA片段,與預(yù)期所設(shè)計目的片段長度相符。該結(jié)果表明本研究設(shè)計的引物對目標(biāo)DNA的擴增是特異有效的。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖 Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 特異性實驗結(jié)果

對香蕉、紅棗、菠蘿、草莓、西紅柿、核桃、大豆、花生、小麥、大麥、玉米、高粱、牛奶、羊奶、大米的樣本分別提取DNA,選取OD260/OD280比值在1.5～2.0的DNA模板進行實時熒光PCR反應(yīng),以避免因模板質(zhì)量不好而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。同時以水代替模板DNA作為空白對照以控制污染。熒光PCR結(jié)果如圖2所示,在40個循環(huán)之內(nèi),只有大米DNA獲得了正常擴增曲線,對奶類主成分牛奶、羊奶、其它谷類和植物性食物對照樣品均無交叉擴增曲線,說明該引物探針體系特異性好。

圖2 大米特異性實驗擴增結(jié)果 Fig.2 Specific amplification results of rice DNA fragments

2.3 靈敏度實驗結(jié)果

利用建立的該引物探針體系分別對100～0.001ng的純大米DNA進行實時熒光PCR擴增。由表2可知,含量為0.1～100ng的純大米DNA的Ct值在 26～38 之間,且重復(fù)性好。而0.01、0.001ng的純大米DNA 未檢測到Ct值,說明0.01、0.001ng的大米DNA無法正常擴增出來。故該方法的檢測靈敏度為0.1ng的純大米DNA。

表2 靈敏度實驗結(jié)果Table 2 Results of the sensitivity test

2.4 模擬樣品中大米成分檢測結(jié)果

對含大米粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、1%、0.5%、0.1%的奶粉樣品的DNA 進行實時熒光PCR檢測。每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)各做3個平行,結(jié)果顯示,5%、1%、0.5%、0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品均出現(xiàn)擴增曲線,Ct值在27～35之間(見圖3)。由此可判斷,該方法可檢測到奶制品中大米粉含量在0.1%(W/W)的樣品。

圖3 奶粉樣品檢出限結(jié)果 Fig.3 Results of the detection threshold analysis for milk powder samples

2.5 市售奶制品的檢測結(jié)果

為進一步驗證該方法的實用性和準(zhǔn)確性,對蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所提供的13份生鮮乳、2份嬰兒奶米粉、1份嬰兒配方羊奶粉、4份嬰兒配方牛奶粉、1份固體乳飲料共計21份市場抽檢奶類樣品進行檢測。

結(jié)果顯示,只有食品標(biāo)簽標(biāo)識的原料成分中含有大米成分的嬰兒奶米粉和標(biāo)識含有大米淀粉成分的嬰兒配方羊奶粉出現(xiàn)正常擴增曲線,Ct值在26～33左右(見圖4),其它均未有擴增曲線。結(jié)果表明該方法能正確的檢測出市售的加工奶制品中的大米成分。說明該方法的檢測靈敏度和特異性可以滿足市售奶類樣品的實用性檢測需要,結(jié)果可靠,可用于奶類食品摻加大米成分的檢測和鑒定。

圖4 市售樣品檢測結(jié)果 Fig. 4 Test results of commercial samples

3 討論

目前國內(nèi)外用于食品摻假摻偽檢測的新興方法主要有光譜分析法(近紅外、中紅外、拉曼光譜、核磁共振光譜、穩(wěn)定同位素和熒光光譜)、色譜分析(氣相和高效液相)、電子鼻、生物技術(shù)(DNA 技術(shù)和酶聯(lián)免疫)等[11-12]。其中利用新興技術(shù)對奶制品摻加米粉(湯)、淀粉、糊精或植物蛋白等植物成分進行檢測的研究也有報道,如利用近紅外光譜分析法檢測奶粉中摻加大豆、豌豆或小麥來源的植物蛋白成分或?qū)接兄参锬逃?植物蛋白,淀粉等植物填充物的牛奶進行檢測鑒別[13-14];利用高效液相色譜分析法對摻偽脫脂奶粉中的植物蛋白成分進行檢測的研究[15]。但上述檢測方法有的需要預(yù)先構(gòu)建摻假模型,且主要檢測對象是蛋白質(zhì),受食品加工方式影響較大,方法的穩(wěn)定性和特異性較差,因此均未納入國家標(biāo)準(zhǔn)。基于DNA的實時熒光PCR方法是一種新興檢測技術(shù),不受加工方式的影響,從摻假成分的來源進行分析,可以彌補上述檢測方法的不足。

根部表達的水稻基因(rice root-specific,gos9)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)基因是目前用于大米成分檢測常選用的內(nèi)源性基因,其適用性已被國內(nèi)外不少研究者所認(rèn)可[6-9]。其中前者是低拷貝基因,后者是單拷貝基因,兼顧方法的特異性和靈敏度,本研究選用根部表達的水稻基因(gos9)作為靶基因設(shè)計引物探針,擴增目的片段長度僅為113bp,受食品加工影響較少。經(jīng)實驗驗證:本方法特異性強,在擴增的40個循環(huán)之內(nèi),只有大米DNA出現(xiàn)特異性擴增,陰性對照組的14種奶類主成分及可能出現(xiàn)在奶類產(chǎn)品中的植物源性成分均無交叉擴增(見圖2);同時也獲得了較高的靈敏度,對大米DNA的檢出限為0.1ng,對奶粉模擬樣品中大米成分的檢測限為0.1%(W/W)。遠高于Lopez[16]等以甜菜堿醛脫氫酶2(Betaine aldehyde dehydrogenase 2,BAD2)基因為靶基因建立的TaqMan 實時熒光PCR方法的靈敏度,后者對純米DNA檢出限為1ng,對印度香米中摻加的非印度香米的檢出限1%。與Hernández等[10]同樣以gos9基因為靶基因建立的檢測大米成分的實時熒光PCR方法的檢出限0.1ng相同。經(jīng)市售奶制品樣品的應(yīng)用性檢測驗證,該方法準(zhǔn)確性好,只對含有大米成分的嬰兒奶米粉和含大米淀粉成分的嬰兒配方羊奶粉呈現(xiàn)陽性擴增,而對不含大米源性成分的其他奶樣品均無擴增(見圖4)。實驗結(jié)果與食品標(biāo)簽標(biāo)識完全一致,說明該方法能夠滿足奶制品中摻加大米源性成分檢測的需求。

研究結(jié)果表明本研究建立的方法具有快速、簡便、特異、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點,可用于市場監(jiān)督奶制品中大米源性成分摻雜摻假的檢測。

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